王 燕，米偉麗，吳 寬

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程分院，陜西楊凌 712100;2.西安理工大學(xué)，西安 710048；3.旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/西北農(nóng)林科技大學(xué) 植保學(xué)院，陜西楊凌 712100)

病毒病是僅次于真菌病的第二大作物病害。由于作物病毒病在生產(chǎn)上易傳播蔓延，每年都給世界作物造成巨大損失。中國是一個農(nóng)業(yè)大國，病毒病嚴重損害水稻、小麥、玉米、馬鈴薯、蘋果、獼猴桃、甜瓜、番茄等農(nóng)作物，因此，有必要研究與開發(fā)新型抗病毒藥物，以采用綠色防控，挽回產(chǎn)量損失。

云芝(Coriolusversicolor)在中國資源豐富[1]。采用多種方法，從云芝菌中提取云芝糖肽，是云芝細菌中的重要活性成分之一，具有提高人體免疫力和抵抗乙肝病毒和乳腺癌疾病的功能[2-7]。Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)噴施云芝糖肽能增加植物體內(nèi)水楊酸的含量，上調(diào)富含亮氨酸的抗病蛋白基因表達量，抵抗煙草花葉病毒(TMV)的感染。在前人抗病毒活性和發(fā)酵技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，本研究優(yōu)化云芝發(fā)酵條件，測定PSP對煙草花葉病毒的鈍化、預(yù)防與治療作用，為工業(yè)化大批量連續(xù)性發(fā)酵生產(chǎn)云芝糖肽提供技術(shù)條件，期望研發(fā)成為一種新的微生物源抗病毒劑[9-12]與廣譜免疫劑[13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵菌株(雜色云芝菌)采集于秦嶺森林腐木上。煙草花葉病毒(TMV)、三生煙(Nicotianatobacumvar.‘Samsun’)和心葉煙(N.glutinosa)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院提供。煙草花葉病毒保存在防蟲紗網(wǎng)內(nèi)三生煙苗上。病毒必克藥劑購買自楊凌農(nóng)藥經(jīng)銷店。PDA液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成：葡萄糖20 g、蔗糖10 g、酵母提取物 2 g、蛋白胨2 g、K2HPO42 g、KH2PO41.5 g、MgSO41.5 g，加入蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 毒力測定 將云芝糖肽發(fā)酵干粉分別配成不同濃度的藥液(10、20、40、60、80、100 mg/L)，選用三生煙3～4葉期幼苗，給葉片均勻摩擦接種TMV，每株接種兩個葉片，7 d后噴施云芝糖肽稀釋液，每個處理38株，21 d后調(diào)查發(fā)病株數(shù)，參照文獻[14]的方法計算藥劑的相對防治率和云芝糖肽發(fā)酵干粉的EC50。

1.2.2 云芝糖肽預(yù)防、治療和鈍化作用的測定 采用半葉枯斑法測定云芝糖肽對TMV的預(yù)防、治療和鈍化效果。預(yù)防作用測定方法：用云芝糖肽水溶液噴施心葉煙左半葉，12 h或24 h后在右半葉接種TMV。治療作用測定方法：在右半葉接種TMV，12 h或24 h后在左半葉噴施云芝糖肽水溶液。鈍化作用測定方法：分別取100 mL云芝糖肽水溶液與100 mL TMV接種液等量混合，分別在1、2和3 h后取混合液，將混合物噴施在心葉煙左半葉，在右半葉接種TMV。每個處理5株，每株處理3個葉片，重復(fù)3次，14 d后調(diào)查心葉煙枯斑數(shù)。對照藥劑病毒必克藥劑稀釋500倍使用。參照文獻[15]的方法計算藥劑的相對抑制率。

1.2.3 培養(yǎng)基成分 碳源篩選：在PDA液體培養(yǎng)基上，只改變碳源，分別加入30 g/L葡萄糖、蔗糖、赤砂糖、淀粉、復(fù)合碳源葡萄糖和蔗糖進行發(fā)酵。氮源選擇：碳源確定后，分別加入酵母提取物與蛋白胨等改變氮源，滅菌后發(fā)酵培養(yǎng)。添加植物油：在篩選碳源和氮源后，培養(yǎng)基中添加1%花生油進行發(fā)酵，所有處理重復(fù)3次，測定云芝的生物量和云芝糖肽的產(chǎn)量。

1.2.4 培養(yǎng)條件 接種量優(yōu)化：將接種液分別按照發(fā)酵液總體積的10%、12%、14%、16%、20%加入發(fā)酵瓶，進行發(fā)酵；培養(yǎng)基pH優(yōu)化：將pH調(diào)為3、4、5、6、6.5、7進行發(fā)酵；轉(zhuǎn)速優(yōu)化：將轉(zhuǎn)速調(diào)為160、180、200、220 r/min進行發(fā)酵；溫度優(yōu)化：溫度分為24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃進行發(fā)酵。所有處理在100 mL/250 mL三角瓶中培養(yǎng)7 d，重復(fù)培養(yǎng)3次，測定云芝的生物量和有效成分產(chǎn)量。

1.2.5 正交試驗設(shè)計 根據(jù)在發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗結(jié)果，選擇赤砂糖(20,30,40 g/L)，酵母提取物(2,3,4 g/L)，蛋白胨(1,2,3 g/L)，磷酸二氫鉀(1,1.5,2 g/L)4因素3水平(序列號1,2,3)。試驗采用4因素3水平L9(34)正交設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 云芝糖肽對TMV的毒力

三生煙葉片接種TMV后，第7天分別噴施10、20、40、60、80、100 mg/L不同濃度的云芝糖肽稀釋液，21 d后調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)酵產(chǎn)物云芝糖肽表現(xiàn)出對TMV有明顯的抗病毒活性，其毒力回歸方程為y=2.38+1.51x,有效抑制中濃度EC50=54.54 mg/L，相關(guān)系數(shù)r=0.986 3。

2.2 云芝糖肽預(yù)防、治療和鈍化作用

將云芝糖肽稀釋液與煙草花葉病毒接種液等量混合，分別處理1 h、2 h、3 h，接種心葉煙葉片，半葉法試驗結(jié)果表明80 mg/L云芝糖肽對煙草花葉病毒的鈍化作用效果顯著，芝糖肽稀釋液對煙草花葉病毒活性的鈍化率依次為45.71%、 62.86%和68.57%(表1)。

表1 云芝糖肽稀釋液對煙草花葉病毒的鈍化活性Table 1 Inactivation effect of PSP on TMV

用云芝糖肽稀釋液對TMV侵染進行預(yù)防試驗，結(jié)果表明，云芝糖肽濃度對TMV侵染有明顯預(yù)防活性， 當噴施80 mg/L濃度稀釋液 12 h和24 h的處理效果分別為54.05%和 64.86%，優(yōu)于對照藥劑效果(表2)。

表2 云芝糖肽稀釋液對煙草花葉病毒的預(yù)防活性Table 2 Prevention effect of PSP on TMV

用云芝糖肽稀釋液對TMV侵染進行治療試驗，結(jié)果表明，在心葉煙被接種TMV后12 h和24 h，分別噴施80 mg/L云芝糖肽稀釋液，治療效果分別為54.55%和51.11%(表3)。

表3 云芝糖肽稀釋液對煙草花葉病毒的治療活性Table 3 Therapy effect of PSP on TMV

2.3 發(fā)酵基質(zhì)成分對云芝糖肽產(chǎn)量的影響

碳源篩選試驗結(jié)果表明，赤砂糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉可以作為云芝秦嶺菌株生長的碳源，赤砂糖效果最好，云芝糖肽產(chǎn)物最多，每升發(fā)酵液為0.81 g(圖1)。

1.葡萄糖+蔗糖;2.葡萄糖;3.蔗糖;4.淀粉1.Glucose+sucrose;2.Glucose;3.Sucrose;4.Starch圖1 碳源對發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon source on fermentation yield

氮源篩選試驗結(jié)果表明，分別添加酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏和大豆蛋白胨，云芝秦嶺菌株生長快速，但當加入酵母提取物與蛋白胨作為時，生物量和云芝糖肽量最高，每升發(fā)酵液中提取的生物量為9.48 g，云芝糖肽為1.48 g。

試驗結(jié)果表明，將1%的花生油添加到優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中，生物量增加5.95%，云芝糖肽的產(chǎn)量增加34.46%(圖2)。

1.酵母提取物+蛋白胨;2.酵母提取物;3.蛋白胨;4.胰蛋白胨;5.牛肉膏;6.大豆蛋白胨1.Yeast extract+peptone;2.Yeast extract;3.Peptone; 4.Tryptone;5.Beef extract;6.Soy peptone圖2 氮源對發(fā)酵產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on fermentation yield

2.4 培養(yǎng)因素對云芝糖肽產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度優(yōu)化試驗結(jié)果表明，隨著發(fā)酵溫度的升高，云芝發(fā)酵液中生物量和云芝糖肽均呈現(xiàn)先上升再下降。發(fā)酵溫度為28 ℃時生物量和云芝糖肽產(chǎn)量最高，每升發(fā)酵液分別為9.38 g和 1.44 g(圖3)。

圖3 溫度對發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.3 Effect of temperature on fermentation yield

酸堿度對發(fā)酵產(chǎn)物影響試驗結(jié)果表明，隨著初始pH的上升，云芝液態(tài)發(fā)酵的生物量和云芝糖肽均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，當發(fā)酵液pH為自然pH 6.5，生物量為最高，達到9.58 g/L，云芝糖肽的產(chǎn)量為最高，每升發(fā)酵液提取1.37 g (圖4)。

圖4 pH對發(fā)酵產(chǎn)物影響Fig.4 Effect of pH on fermentation yield

發(fā)酵瓶轉(zhuǎn)速對發(fā)酵產(chǎn)物影響試驗結(jié)果表明，隨著發(fā)酵速度的加快，云芝發(fā)酵的生物量和云芝糖肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢。當發(fā)酵瓶轉(zhuǎn)速為200 r/min，每升發(fā)酵液中生物量和云芝糖肽產(chǎn)量達最高，分別為8.87 g和1.47 g。菌種接種量試驗結(jié)果表明：隨著接種量的增加，云芝液體發(fā)酵的生物量呈上升趨勢，但產(chǎn)量逐漸下降。接種量為10%時，云芝糖肽最高產(chǎn)量為每升發(fā)酵液提取1.76 g。

多因素正交試驗結(jié)果表明，每升培養(yǎng)基中赤砂糖40 g、酵母提取物3 g、蛋白胨1 g和磷酸二氫鉀2 g時，活性產(chǎn)物云芝糖肽產(chǎn)量最高，達到每升發(fā)酵液中云芝糖肽為1.45 g。比較所有因素對生物量和云芝糖肽二者的影響因素，結(jié)果表明所有因素對生物量和云芝糖肽的影響基本相同，說明生物量和云芝糖肽產(chǎn)量存在正相關(guān)。

3 討 論

臨床觀察發(fā)現(xiàn)云芝糖肽表現(xiàn)出調(diào)節(jié)免疫和抗病毒等多種功能，目前作為醫(yī)藥廣泛使用[4-6]。云芝糖肽是從云芝液態(tài)發(fā)酵菌絲體中提取出來的蛋白多糖[7-10]。本研究發(fā)現(xiàn)云芝胞內(nèi)糖肽對TMV有顯著的鈍化、預(yù)防和治療作用，說明云芝糖肽在植物病毒病防治上具有重要的應(yīng)用價值。通過對分離得到的秦嶺雜色云芝菌液態(tài)發(fā)酵，獲得云芝糖肽液態(tài)發(fā)酵基質(zhì)與發(fā)酵優(yōu)化條件，確定的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：赤砂糖40 g/L、酵母提取物3 g/L、蛋白胨2 g/L、K2HPO42 g/L、KH2PO42 g/L、MgSO41.5 g/L、花生植物油1%。最佳發(fā)酵條件為初始pH6.5、接種量10%、溫度27 ℃、轉(zhuǎn)速200 r/min，液體發(fā)酵培養(yǎng)7 d，可以獲得高表達的云芝糖肽，取得云芝糖肽發(fā)酵生產(chǎn)條件，有助于產(chǎn)業(yè)化研究[13-16]。

目前，通過液體發(fā)酵獲得云芝糖肽是最常用方法。盡管云芝糖肽的液態(tài)發(fā)酵國內(nèi)外已有一些研究，但不同的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件嚴重影響云芝糖肽的發(fā)酵產(chǎn)量。本研究所用菌株是通過實驗室鑒定和篩選獲得的優(yōu)良菌株。在單因素篩選基礎(chǔ)上，進一步正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，最后取得重要的發(fā)酵技術(shù)參數(shù)。