付 博，王家哲，李英梅，張淑蓮，郝 哲，張 鋒

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，西安 710600；3.榆林市農(nóng)墾服務(wù)中心，陜西榆林 719000)

羊肚菌(Morchellaspp.)是世界范圍內(nèi)廣泛分布的珍稀、名貴食藥用真菌，為子囊菌門(Ascomycota)、盤菌綱(Pezizomycetes)、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌屬(Morchella)，其屬模式種是Morchellaesculenta(L.) Pers.[1]。為進一步保護羊肚菌的自然生態(tài)和種質(zhì)資源，近年來中國人工栽培羊肚菌發(fā)展迅速，全國羊肚菌栽培面積至2019年已超過8 000 hm2[2-4]。隨著羊肚菌栽培規(guī)模的逐步擴大，羊肚菌霉菌性枯萎病在四川、湖北、陜西等主要栽培地普遍發(fā)生，該病原菌主要侵染子囊果，溫度高于25 ℃和相對濕度高于90%條件下病害迅速擴展，可引起患病部位的枯萎、腐爛和子實體畸形，成為近年來嚴重影響羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的真菌性病害，由于該病害發(fā)生范圍廣、傳播速度快、缺乏有效防治手段，每年有近70%的種植戶無法獲得穩(wěn)定收益[5-7]。

目前，關(guān)于羊肚菌霉菌性枯萎病的病原菌有一定的爭議，有報道顯示該病原菌為長孢卵單隔孢霉(Diploosporalongispora)[7]，也有報道稱其病原菌為Paecilomycespenicillatus[8]，早期NCBI數(shù)據(jù)庫的部分學者將D.longispora定名為擬青霉屬的種，但是兩種菌體的分生孢子有顯著差異，長孢卵單隔孢霉的分生孢子有橫隔，而擬青霉屬的分生孢子沒有橫隔，在進行序列BLAST比對時較難區(qū)分，必須結(jié)合菌體細胞形態(tài)觀察[9-10]。

本文對陜西省發(fā)生的羊肚菌霉菌性枯萎病的病原真菌進行分離鑒定，以明確其種類和分類地位，并進一步研究病原菌的生物學特性，為該病害的研究與防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試病樣及羊肚菌品種

羊肚菌霉菌性枯萎病樣，采集于陜西省榆林市馬合農(nóng)場食用菌產(chǎn)業(yè)科技示范園。供試羊肚菌品種為‘六妹羊肚菌’(M.sextelata)。

1.2 主要試劑和儀器

PCR所用Buffer、TaqMix等購自北京鼎國生物技術(shù)公司；DL2000 DNA Marker、Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。離心機Centrifuge5415D、Centrifuge5810R、PCR儀、微量可調(diào)移液器均購自Eppendorf公司；顯微鏡為奧林巴斯BX21；凝膠成像系統(tǒng)購自SYNGENE公司，電泳儀購自Bio-RAD公司，培養(yǎng)箱、水浴鍋等均為國產(chǎn)儀器。

1.3 病原菌的分離和純化

用解剖針挑取羊肚菌病灶處白色菌絲，置于PDA培養(yǎng)基進行分離(含終濃度為30 mg/L的鏈霉素)，單孢純化法對病原菌進行純化，培養(yǎng)溫度25 ℃。獲得的純培養(yǎng)物置于PDA斜面4 ℃保藏[11]。

1.4 致病性測定

將分離純化的病原真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基，25 ℃、培養(yǎng)14 d至產(chǎn)孢，制備孢子懸液 (1.0×105CFU/mL)。用75%酒精對羊肚菌表面進行消毒，無菌手術(shù)刀在菌蓋上切約5 mm的傷口，并在傷口處滴加200 μL的孢子懸液，以滴加無菌水為空白對照，設(shè)置15個重復(fù)，接種病原菌后用塑料杯罩住羊肚菌進行保濕，每天觀察并記錄發(fā)病情況，待菌蓋上出現(xiàn)病癥后，按照上述“1.3”的分離純化方法再次分離純化病原物。

1.5 病原菌的形態(tài)學鑒定

將分離純化的病原分離物，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃，培養(yǎng)14 d，觀察菌落形態(tài)。待病原菌產(chǎn)生分生孢子后，溶于無菌水并置于顯微鏡觀察分子孢子形態(tài)。

1.6 病原菌的分子生物學鑒定

挑取待測病原菌的菌絲，采用Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒提取病原真菌的基因組DNA，-20 ℃儲存?zhèn)溆?。采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[12]擴增病原菌的rDNA ITS序列。PCR反應(yīng)體積50 μL：TaqPCR Master Mix 25 μL，模板DNA 1 μL，正、反向引物各2 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。8 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，送北京擎科生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果提交NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST序列比對，采用MEGA 6.0軟件的自舉法(Bootstrap)進行1 000次重復(fù)檢驗，鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.7 病原菌的生物學特性

1.7.1 不同溫度對菌絲體生長的影響 打孔器(直徑5 mm)打取在PDA平板上生長的病原真菌Y1菌餅，將菌餅放置于新鮮的PDA平板中央，分別置于不同的培養(yǎng)溫度：10 ℃、15 ℃、 20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、35 ℃，每個處理3次重復(fù)，每隔24 h記錄菌落直徑，分析溫度對病原菌菌絲體生長的影響。

1.7.2 不同pH對菌絲體生長的影響 PDA平板培養(yǎng)、25 ℃條件下，分別設(shè)置培養(yǎng)基的pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，參照 “1.7.1”的處理方法，每隔24 h記錄菌落直徑，分析pH對病原菌Y1菌絲體生長的影響。

1.7.3 不同碳源對菌絲體生長的影響 25 ℃、pH 6.5條件下，以察氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同碳源：乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖，參照“1.7.1”的處理方法，每隔24 h記錄菌落直徑，分析碳源對病原菌Y1菌絲體生長的 影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離與致病性檢測

羊肚菌霉菌性枯萎病主要發(fā)生在羊肚菌子囊果的菌蓋上，病斑表面有白色絨毛狀菌絲，最終引起患病部位的枯萎、腐爛和子實體畸形(圖1-A)。從采集點患病羊肚菌中共分離出6株真菌，編號為Y1～Y6，用于致病性測定。

將分離物在羊肚菌子囊果菌蓋上進行回接，檢測其致病性，塑料大棚內(nèi)空氣溫度20 ℃，相對濕度60%左右。結(jié)果顯示，Y1、Y2、Y3、Y 6四株真菌在回接第3天出現(xiàn)相同病癥即肉眼可見的白色病斑，而后病斑逐漸擴大(圖1-B、1-C、1-D)，與田間病原菌為害的癥狀相同，回接患病率100%，無菌水回接的空白對照傷口處未見為害癥狀(圖1-E)。從病患處再次挑取白色菌絲進行分離培養(yǎng)、純化，獲得的二次分離物與回接菌株的菌落形態(tài)一致，證實菌株Y1、Y2、Y3、Y6是羊肚菌霉菌性枯萎病的病原真菌。

A.羊肚菌田間患病癥狀; B-D.致病菌孢子創(chuàng)傷侵染后第3、4和6天的發(fā)病癥狀; E.無菌水對照創(chuàng)傷侵染后第6天的癥狀A(yù).Naturally infected morel in the field; B-D.Symptoms observed in 3, 4 and 6 days after wound-inoculation of healthy morels with fungal suspensions;E.Symptoms observed 6 days after wound-inoculation with sterile water圖1 羊肚菌霉菌性枯萎病的田間癥狀及病原菌致病性檢測Fig.1 Pileus rot disease of Morchella importuna and pathogenicity detection of isolate

2.2 病原菌的形態(tài)學鑒定

4株病原真菌的菌體形態(tài)一致，PDA平板 25 ℃培養(yǎng)6 d后菌落直徑達30 mm左右，菌體生長較慢(圖2-A、2-B)。菌落呈白色絨毛狀、較致密，微凸起，不分泌色素。顯微鏡(40×)觀察分生孢子無色透明、長棒狀、有1個分隔，大小(3～5)μm×(19～25)μm(圖2-C)；菌絲為透明、有分隔、直徑約2～4 μm(圖2-D)，與文獻[7]描述的一致，初步鑒定為孢卵單隔孢霉(D.longispora)。

A、B.病原菌在PDA培養(yǎng)基25 ℃生長6 d的菌落形態(tài) ；C.分生孢子；D.厚垣孢子和菌絲A，B.Colony of pathogenic isolate grown on PDA at 25 ℃ for 6 days；C.Conidia；D.Chamydospores and hyphae圖2 病原菌的菌落、菌絲和孢子形態(tài)Fig.2 Morphological characteristics of colonies, hyphae and conidia of isolate

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

菌株Y1、Y2、Y3和Y6的PCR擴增ITS序列大小分別為550 bp、545 bp、552 bp和556 bp，將序列提交至GenBank(登錄號分別為MW922714、MW922715、MW922716、MW922 717)，BLAST序列比對結(jié)果顯示，菌株Y1的ITS序列與D.longispora(KX223838)序列相似性分別為99.42%，菌株Y2、Y3和Y6與D.longispora(MH882725)序列相似性均為 99.8%?；贗TS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示(圖3)，菌株Y1、Y2、Y3和Y6與D.longispora和P.penicillatus在自舉值99%水平上聚在同一個進化分支。在NCBI網(wǎng)站上長孢卵單隔孢霉和擬青霉屬的ITS序列非常相似，因此要結(jié)合菌體形態(tài)特征進行綜合分析，長孢卵單隔孢霉的分生孢子有橫隔，而擬青霉屬的分生孢子沒有橫隔，因此將菌株Y1、Y2、Y3和Y6鑒定為D.longispora[13]。

比例尺表示遺傳距離。 節(jié)點上主要譜系的1 000次重復(fù)的bootrap值以百分比表示The scale bar indicates genetic distance.Bootsrap values in 1 000 replicates for major lineages at the nodes are shown as percentages圖3 基于菌株Y1、Y2、Y3和Y6的rDNA ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbor-joining pgylogenetic tree based on rDNA ITS sequences of Y1, Y2, Y3 and Y6 strain

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 不同溫度對菌體生長的影響 病原菌Y1在15～25 ℃內(nèi)可正常生長，但不同溫度對菌株生長具有顯著影響，在培養(yǎng)溫度25 ℃時，盡管生長速率較慢，菌體長勢最好；當溫度為10 ℃或高于28 ℃時，菌體生長受限，溫度為30 ℃時菌體停止生長(圖4)。

圖4 不同溫度對菌株Y1的生長Fig.4 Growth of strain Y1 under treatment of different temperatures

2.4.2 不同pH對菌體生長的影響 不同pH培養(yǎng)條件下病原菌Y1生長情況具有顯著性差異，菌株在偏酸性條件下生長較好，當培養(yǎng)基pH小于6.5時，培養(yǎng)至第7天和第10 天，菌落直徑分別大于36.17 mm和40.17 mm，菌株的長勢較好，因此在培養(yǎng)該病原菌時，培養(yǎng)基pH可設(shè)置為5.5～6.5。此外，還發(fā)現(xiàn)該病原菌在堿性培養(yǎng)條件下具有一定的耐受能力，當pH 9時仍能生長(表1)。

表1 不同pH培養(yǎng)條件下菌體Y1生長Table 1 Growth of strain Y1 under different pH

2.4.3 不同碳源對菌體生長的影響 不同碳源培養(yǎng)條件下病原菌Y1生長情況具有顯著性差異，以蔗糖為碳源時菌體生長最快，生長速度為2.89 mm/d；其次為乳糖作為碳源，菌體生長速度為2.63 mm/d；麥芽糖為碳源時，菌體生長最慢2.30 mm/d，因此在菌株培養(yǎng)時應(yīng)添加蔗糖為主要碳源(圖5)。

不同小寫字母代表Duncan’s分析結(jié)果，不同處理間的差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters in the figure indicate significant differences at the level of P<0.05 after Duncan’s multiple range method test圖5 不同碳源下菌株Y1的生長Fig.5 Growth of strain Y1 under different carbon sources

3 討論與結(jié)論

目前，有報道羊肚菌霉菌性枯萎病的病原菌為長孢卵單隔孢霉(D.longispora)[7]，另有研究顯示羊肚菌白霉病與霉菌性枯萎病非常相似，其病原菌為擬青霉屬真菌(P.penicillatus)[8,14]，此后又報道了田間癥狀非常相似的羊肚菌白腐病，該病原菌被鑒定為曲霉屬真菌(Aspergillussp.)[15]。盡管這幾種病害的田間癥狀極為相似，但是分離鑒定的病原菌卻不同，這為明確羊肚菌子實體菌蓋上的真菌病原帶來一定困難。

采用分子生物學手段，基于18Sr DNA、ITS、β-微管蛋白(TUB)、延伸因子(TEF)等保守區(qū)域進行PCR擴增，可用于真菌的分類鑒定[16-17]，但是由于D.longispora和P.penicillatus兩種菌株的ITS序列非常相似，必須結(jié)合菌體形態(tài)特征加以區(qū)分。

目前關(guān)于P.Penicillatus的系統(tǒng)分類存在爭議，早期認為擬青霉屬半知菌亞門、絲孢科或叢梗孢科，后來《真菌鑒定手冊》把擬青霉屬歸為真子囊亞綱曲霉科，擬青霉屬主要是基于產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征進行分類鑒定，其中最主要的一個判定依據(jù)是其具有分生孢子梗、瓶梗著生于營養(yǎng)菌絲或分生孢子梗上、分生孢子無橫隔[18-19]。這一產(chǎn)孢特征與D.longispora明顯不同。

有關(guān)雙孢菌屬Diploospora的相關(guān)研究并不多，最早在羊皮紙上發(fā)現(xiàn)了D.rosea并將其定義為該屬的模式種，在后續(xù)的研究中又發(fā)現(xiàn)了與其菌絲和孢子形態(tài)非常相似的菌種D.longispora，D.indica，D.fungicola，D.coprophila，D.zinnia，其分生孢子呈柱形或紡錘形，可呈鏈狀排列，大部分分生孢子含有1～3個橫隔。盡管ITS序列極為相似，但D.longispora與P.penicillatus的產(chǎn)孢過程和孢子形態(tài)顯著區(qū)別，可以作為區(qū)分兩種菌的主要依據(jù)[9,20-21]。

本研究分離得到了羊肚菌菌蓋上的4株病原真菌，經(jīng)ITS序列比對和菌體形態(tài)分析，最終確定是引起羊肚菌霉菌性枯萎病的D.longispora，與 He等[7]的研究結(jié)果一致。研究病原菌的生物學特性不僅有助于了解病原菌的生長偏好，還能為揭示病原菌的發(fā)生規(guī)律提供理論參考。本研究顯示，D.longispora的最適生長溫度為25 ℃；菌株在偏酸性條件下生長較好，pH 5.5～6.5為最佳，并在堿性條件下具有一定的耐受能力；最佳利用碳源為蔗糖。

羊肚菌具有極高的營養(yǎng)保健和藥用價值，近年來人工栽培規(guī)模逐漸擴大，產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，隨之而發(fā)生的病蟲害也逐漸加重，明確病原菌及其發(fā)生規(guī)律對于羊肚菌的健康栽培至關(guān)重要[22]。本研究結(jié)果明確了羊肚菌霉菌性枯萎病的病原菌是D.longispora，對其生物學特性進行分析，為今后開展病害的發(fā)生規(guī)律研究、制定有效防治方案具有重要的指導(dǎo)意義。