劉學杰，張俊生,杜麗君，馬靜華

(1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 煙臺 264000；2.煙臺市中醫(yī)醫(yī)院，山東 煙臺 264000)

仙芪扶正顆粒是由仙鶴草、黃芪、陳皮、黨參、茯苓、酒黃精、枸杞子、酒女貞子、鹽菟絲子、當歸、雞血藤、地榆、大棗、甘草14味中藥經(jīng)過水煎提取而制成的醫(yī)療機構復方制劑，經(jīng)大量臨床實踐證明該制劑對于腫瘤放化療后血細胞減少癥及食少納呆、體倦乏力等脾腎虛弱、氣血虧虛之癥具有很好的治療效果。本方臨床使用已有十余年，具有堅實的臨床基礎。仙芪扶正顆粒目前并無明確的質量標準，為了更好地對仙芪扶正顆粒的質量加以控制，本文作者在查閱相關文獻[1-4]基礎上開展研究，方中君藥仙鶴草并無明顯的指標性成分可供做含量測定，黃芪雖有指標性成分黃芪甲苷，但本文作者嘗試后發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷回收率不符合要求，因此本文選擇對陳皮中橙皮苷進行含量測定。此外，本文除了對黃芪、枸杞子、陳皮、地榆進行薄層鑒別外，還參照《中國藥典》2020年版(一部)對茯苓、黃精、酒女貞子、鹽菟絲子、當歸、雞血藤等進行定性研究，結果發(fā)現(xiàn)以上各位藥材薄層色譜干擾嚴重，其樣品的分離度未能達到制定標準的要求，故在初步制定標準的過程中未納入正文。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國安捷倫1200高效液相色譜儀；日本島津 Auw120D電子天平；KQ-300DE超聲波儀器。青島基億達硅膠G板；水為Milipore制水機制備。

1.2 試藥 黃芪甲苷(批號：110781-201717)、黃芪(批號：120974-201612)、枸杞子(批號：121072-201611)、橙皮苷(批號:110721-201818)、地榆(批號：121286-201703)均購自中國食品藥品檢定研究院；仙芪扶正顆粒樣品及陰性供試品為制劑室自制(批號分別為20190501、20190502、20190503)；乙腈為進口色譜純(Fisher)；試驗中所用其他試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪 取本品適量，研細，稱取10 g置圓底燒瓶，水浴回流1 h，取濾液蒸干，殘渣分次加水20 mL使溶解并轉移至分液漏斗中，以水飽和的正丁醇30 mL萃取2次，正丁醇液以2% NaOH溶液洗滌2次，每次40 mL，棄去洗液，加正丁醇飽和的水液50 mL洗滌，取正丁醇液置水浴使蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取黃芪對照藥材1 g(購自中國食品藥品檢定研究院)同法制成對照藥材溶液。另取黃芪甲苷對照品加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液[5]。取上述制備液于同一色譜板展開，結果見圖1。

1.缺黃芪空白；2.黃芪甲苷；3.黃芪；4、5、6.三批供試品

2.2 枸杞子 取本品10 g，研細，加水50 mL使溶解，超聲30 min，濾過，取濾液用乙酸乙酯30 mL萃取2次，合并萃取液置水浴蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為供試品溶液。

另取枸杞子對照藥材1 g(購自中國食品藥品檢定研究院)同法制成枸杞子對照藥材溶液[6]。取上述制備液于同一色譜板展開，結果見圖2。

1.缺枸杞子空白；2.枸杞子；3、4、5.三批供試品

2.3 陳皮 取本品18 g，研細，加乙醇50 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL，微熱使溶解，乙醚提取2次，每次20 mL,棄去乙醚液，水液用水飽和的正丁醇液40 mL分兩次提取，再以正丁醇飽和的水50 mL分次洗滌，取正丁醇液，蒸干，加甲醇2 mL溶解殘渣，作為供試品溶液。另取橙皮苷0.5 mg加甲醇1 mL使溶解，作為對照品溶液。取上述制備液于同一色譜板展開，結果見圖3。

1.缺陳皮空白；2.橙皮苷；3.陳皮；4、5、6.三批供試品

2.4 地榆 另取地榆對照藥材0.5 g,加甲醇20 mL回流提取30 min，放置室溫，取濾液蒸干，殘渣分次加水20 mL使溶解，并轉移至分液漏斗，用水飽和的正丁醇40 mL分兩次萃取，合并萃取液，分別用2% NaOH溶液和正丁醇飽和的水洗滌2次，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇2 mL溶解，作為地榆對照藥材溶液。取“2.1”項下制備液于同一色譜板展開，結果見圖4。

1.缺地榆空白；2.地榆對照藥材；3、4、5.三批供試品

3 橙皮苷含量測定

3.1 溶液的制備

3.1.1 樣品處理及供試品溶液的制備 取裝量差異下的本品內容物，研細，精密稱定3 g置平底燒瓶，精密加入甲醇50 mL，秤定，水浴回流1 h，放冷，用甲醇補足減少重量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

3.1.2 對照品溶液的制備 取橙皮苷對照品11.45 mg加甲醇制成每1 mL含橙皮苷45.8 μg的溶液，作為對照品溶液。

3.1.3 缺陳皮空白溶液的制備 取陳皮陰性供試品按照“3.1.1”項下制備方法，制成陳皮陰性供試品溶液。

3.2 色譜條件 色譜柱：C18柱；流動相：乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)；檢測波長：283 nm，柱溫箱溫度30 ℃[5,7]。理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應不低于2 000。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗

3.3.1 專屬性試驗 分別取上述“3.1.1”“3.1.2”“3.1.3”項下制備溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。結果表明，供試品色譜中，在與橙皮苷對照品色譜相應位置上，有相同的吸收峰，而陳皮陰性供試品溶液色譜無明顯干擾，見圖5～7。

圖5 橙皮苷對照品

圖6 供試品

圖7 缺陳皮供試品

3.3.2 線性關系考察 取橙皮苷對照品溶液分別進樣0.114 5、0.229、0.458、0.572 5、1.374、2.29 μg，按照“3.2”項下色譜條件進行測定。以峰面積積分值的對數(shù)為縱坐標(Y)，進樣量(μg)為橫坐標(X)，繪制標準曲線，結果進樣量在0.114 5～2.29 μg范圍內線性關系良好。對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，得回歸方程：Y=25.627X+1.775 6，r=0.999 7，結果見表1，線性關系見圖8。

表1 線性關系考察結果

圖8 橙皮苷的標準曲線

3.3.3 精密度試驗 取同份仙芪扶正顆粒，按照“3.1”項下方法制備成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10 μL。結果6次測定峰面積的RSD為0.60%，表明精密度良好(見表2)。

表2 精密度試驗結果

3.3.4 穩(wěn)定性試驗 取同份仙芪扶正顆粒，按照“3.1”項下制備成供試品溶液，每隔約2 h進樣測定1次，每次進樣10 μL，共測定6次。結果顯示，6次測定橙皮苷測定峰面積RSD為1.46%，表明在10 h內橙皮苷的穩(wěn)定性良好(見表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗結果

3.3.5 重復性試驗 取同一批仙芪扶正顆粒(批號：20190501)樣品6份，按含量測定項下，依法測定含量，6次測定結果范圍在0.611～0.624 mg·g-1，RSD為0.97%，說明重現(xiàn)性良好，結果見表4。

表4 重現(xiàn)性試驗結果

3.3.6 加樣回收率試驗 取同一批仙芪扶正顆粒(批號：20190501)樣品6份，每份約1.5 g，精密稱定，分別以低、中、高3個水平精密加入橙皮苷對照品0.757、0.947、1.136 mg，按照“3.1.1”項下制備成供試品溶液，并按照“3.2”項下方法進行測定并計算回收率，結果見表5。

表5 回收率試驗結果

3.3.7 樣品的測定 取不同批次的仙芪扶正顆粒6份，按照“3.1.1”項下制備成供試品溶液，按照“3.2”項下方法進行測定并計算6批仙芪扶正顆粒樣品中橙皮苷的含量，結果見表6。

表6 6批仙芪扶正顆粒中橙皮苷的含量測定結果

從以上6批中試生產(chǎn)的仙芪扶正顆粒中橙皮苷的含量可知，每克樣品中橙皮苷的含量范圍為0.61～0.63 mg·g-1，考慮到陳皮藥材的質量差異，按照《中國藥典》2020年版(一部)規(guī)定橙皮苷的含量不得低于3.5%，故規(guī)定橙皮苷的含量每袋不得少于3.60 mg(8 g/袋)。

4 討論

4.1 含量測定中橙皮苷提取方法及時間的選擇 橙皮苷的提取試驗考察了超聲和回流兩種不同的方法，結果發(fā)現(xiàn)回流雖比超聲操作煩瑣，但是更能夠使橙皮苷提取完全。試驗中用加熱回流方法提取橙皮苷分別考察了40、60和80 min的提取時間，結果表明60 min基本可以使橙皮苷提取完全，因此本文確定加熱回流60 min作為橙皮苷的提取方法。

4.2 檢測波長及流動相的選擇 本文取橙皮苷對照品溶液進行掃描(200～400 nm)發(fā)現(xiàn)橙皮苷在283.0 nm處有最大吸收，結合相關參考文獻，故確定本文含量測定的波長為283 nm。試驗中對作者嘗試用甲醇-冰醋酸-水(35∶4∶61)[8]以及甲醇-0.11%磷酸溶液(39∶61)[9]作為流動相結果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)能夠使樣品中橙皮苷分離效果較好且配置簡單，故本文采用乙腈-0.01%磷酸溶液(20∶80)作為流動相。