武建卓，彭潔，王婷婷，李雪

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663)

紅霉素為大環(huán)內(nèi)酯類多組分抗生素，目前評價其質(zhì)量的關(guān)鍵項(xiàng)目含量測定的基本方法是微生物檢定法。該法存在操作步驟多，試驗(yàn)過程長，影響結(jié)果的人為因素多等缺點(diǎn)。多組分抗生素不同組分生物活性存在差異，且各組分之間的活性存在協(xié)同或拮抗等情況，組效之間是非線性關(guān)系，不能簡單用組分含量等理化測定結(jié)果來準(zhǔn)確表征藥品質(zhì)量[1]。為此，引入GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，對多組分抗生素的高度非線性化學(xué)成分表征信息和效價進(jìn)行處理，綜合運(yùn)用模式識別技術(shù)中的各種計算方法和手段才可能有效地解決多組分抗生素質(zhì)量評價難題，實(shí)現(xiàn)基于儀器分析數(shù)據(jù)之上的多組分抗生素質(zhì)量智能辨識與評價，以期替代傳統(tǒng)的微生物檢定法。

遺傳算法(GA)是模擬自然演化過程搜索全局最優(yōu)解的方法，它的群體性搜索策略使其不易陷入局部最優(yōu)，而且其定義域可以任意設(shè)定，使得遺傳算法的應(yīng)用范圍大大擴(kuò)展，方便與其他算法相結(jié)合。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法本質(zhì)上為梯度下降法，所以容易陷入局部最優(yōu)。鑒于遺傳算法的優(yōu)點(diǎn)和BP 網(wǎng)絡(luò)存在的缺陷，本文將兩者結(jié)合使用，利用遺傳算法不易陷入局部最優(yōu)的特性，補(bǔ)償BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)梯度下降易于陷入局部最優(yōu)的缺陷[2]。

本試驗(yàn)收集了紅霉素腸溶片的組分測定和效價測定數(shù)據(jù)，采用GA-BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)建立模型，對網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行學(xué)習(xí)后對紅霉素腸溶片效價進(jìn)行預(yù)測，并對預(yù)測準(zhǔn)確度進(jìn)行了研究，本試驗(yàn)利用Python 編程軟件實(shí)現(xiàn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Shimadzulc-20AT液相色譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；ZY300-IV抑菌圈測量儀；C2933隔水式培養(yǎng)箱。

1.2 試藥 紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號：130307-201417)與紅霉素系統(tǒng)適用性對照品(批號：130670-201501)由中國食品藥品檢定研究院提供；紅霉素雜質(zhì)A、紅霉素雜質(zhì)B、紅霉素雜質(zhì)C、紅霉素雜質(zhì)D、紅霉素雜質(zhì)E與紅霉素雜質(zhì)F對照品由Toronto Research Chemicals Inc提供；紅霉素B與紅霉素C為《歐洲藥典》(EP)對照品；甲醇與乙腈為色譜純，由Honeywell International Inc提供；水為超純水，其余試劑均為分析純。

本試驗(yàn)總共測定了552批次的紅霉素腸溶片樣品，其中235批次紅霉素腸溶片來自2012年國家評價性抽驗(yàn)，涉及的生產(chǎn)企業(yè)37個，涉及批準(zhǔn)文號數(shù)38個,原料藥來自紅霉素5個主流原料生產(chǎn)廠的原料；317批次紅霉素腸溶片來自2017年國家評價性抽驗(yàn)，涉及的生產(chǎn)企業(yè)28個，涉及批準(zhǔn)文號數(shù)28個,原料藥來自紅霉素3個主流原料生產(chǎn)廠的原料。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅霉素腸溶片組分測定[3]按照《中國藥典》2020年版(二部)紅霉素項(xiàng)下“紅霉素組分”條件測定，按扣除輔料峰外峰面積歸一化法計算供試品中紅霉素組分A、紅霉素組分B、紅霉素組分C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F和總雜質(zhì)的百分含量。圖譜見圖1～2。

圖1 系統(tǒng)適用性圖譜

圖2 供試品圖譜

2.2 紅霉素腸溶片效價測定 參照《中國藥典》2020年版(二部)附錄抗生素微生物檢定法進(jìn)行測定。

2.3 GA-BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)模、訓(xùn)練和預(yù)測

2.3.1 BP網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)設(shè)計 根據(jù)紅霉素腸溶片組分含量來推斷其效價，類似于天然藥物定量組效關(guān)系的研究，適合采用GA-BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)較準(zhǔn)確的定量預(yù)測[4]。網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的設(shè)計包括確定輸入與輸出層的節(jié)點(diǎn)數(shù)目、隱層的數(shù)目、每個隱層節(jié)點(diǎn)的數(shù)目。根據(jù)紅霉素腸溶片組分測定數(shù)據(jù)集，選擇紅霉素組分A、紅霉素組分B、紅霉素組分C、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)F和總雜質(zhì)共10個變量因素作為網(wǎng)絡(luò)的輸入數(shù)據(jù)，以抗生素微生物檢定法測得的效價作為網(wǎng)絡(luò)的輸出數(shù)據(jù)。根據(jù)Kolmogorov定理，三層BP網(wǎng)絡(luò)充分學(xué)習(xí)后能逼近任何函數(shù)，因此構(gòu)建三層結(jié)構(gòu)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。隱含節(jié)點(diǎn)數(shù)的確定有很多經(jīng)驗(yàn)法則，本文取2n+1個的隱含層結(jié)點(diǎn)數(shù)，其中n為輸入層的結(jié)點(diǎn)個數(shù)。因此這里隱含層結(jié)點(diǎn)數(shù)為21個。輸出層包含1個節(jié)點(diǎn)，輸出紅霉素腸溶片效價[5-8]。

2.3.2 GA-BP人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)設(shè)置[9-10]GA初訓(xùn)練參數(shù)設(shè)置:設(shè)置種群規(guī)模N=50、交叉概率為0.85、變異概率為0.05、最大進(jìn)化代數(shù)1 000，當(dāng)最優(yōu)個體的適應(yīng)度函數(shù)比值E<1.05時訓(xùn)練結(jié)束。

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)設(shè)置:初訓(xùn)練結(jié)束后,改用BP算法進(jìn)行局部搜索。訓(xùn)練過程中，訓(xùn)練要求精度為0.001、最大失敗次數(shù)20、學(xué)習(xí)速率為0.1，最大訓(xùn)練次數(shù)1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)值，經(jīng)多次訓(xùn)練直至達(dá)到誤差限。

2.4 紅霉素腸溶片組分測定數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況 本試驗(yàn)共獲得552批次紅霉素腸溶片測定數(shù)據(jù)，設(shè)置訓(xùn)練組和測試組，其中訓(xùn)練組隨機(jī)抽取502個批次測定樣品數(shù)據(jù)用于構(gòu)建模型，測試組則取剩余50個批次測定樣品數(shù)據(jù)用于評價模型的預(yù)測能力。對兩組數(shù)據(jù)采用T檢驗(yàn)比對各組分含量，結(jié)果兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有可比性，結(jié)果見表1。

表1 紅霉素腸溶片的樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計情況

2.5 紅霉素腸溶片效價預(yù)測 對測試組的50個批次紅霉素腸溶片樣品的效價進(jìn)行預(yù)測，并與實(shí)際測定效價數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，檢驗(yàn)預(yù)測效果。結(jié)果預(yù)測效價誤差百分率最高值為-4.61%，均未超過5%，誤差百分率平均值為2.22%，優(yōu)于一般儀器分析相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.50%，說明模型具有較高的效價預(yù)測精度，而且穩(wěn)定性也較好，因而具有較強(qiáng)的預(yù)報能力。結(jié)果見表2。

表2 紅霉素腸溶片測定效價與預(yù)測效價的比較

3 討論

目前，《中國藥典》2020年版應(yīng)用微生物檢定法進(jìn)行含量測定的抗生素品種仍有84個。由于微生物檢定法操作步驟復(fù)雜，試驗(yàn)周期長，對操作人員技術(shù)熟練度和操作細(xì)致度要求高等諸多缺點(diǎn)，采用微生物檢定方法進(jìn)行含量測定的比重正在不斷縮小，尤其在《歐洲藥典》《英國藥典》中HPLC法具有明顯的替代趨勢。但是由于國內(nèi)絕大多數(shù)多組分抗生素的量效統(tǒng)一工作尚未完成，各化學(xué)成分的含量還無法完整的反應(yīng)藥品的內(nèi)在質(zhì)量情況，HPLC 法的替代應(yīng)用還是要審慎進(jìn)行。

本文針對紅霉素類抗生素為多組分抗生素的特點(diǎn)，引入GA-BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，對多組分抗生素的高度非線性化學(xué)成分表征信息和效價進(jìn)行處理，在多種化學(xué)組分與藥物效價間建立起定量關(guān)系模型，通過預(yù)測效價值來評價藥品質(zhì)量，替代傳統(tǒng)的微生物檢定法，改善多組分抗生素微生物檢定法測定中諸多缺陷，提高多組分抗生素的質(zhì)量控制水平，從實(shí)際結(jié)果來看，取得了不錯的效果。