鄭紅，盧蘭香，程志，于文江，宿書芳，孫立臻，劉艷明

（山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，濟(jì)南 250101）

0 引言

季銨鹽類消毒劑是一類廣譜高效消毒劑，常用于畜舍、擠奶和盛奶容器的消毒，有報(bào)道指出此類消毒劑通過接觸遷移污染原料奶，進(jìn)而引起人類哮喘、皮膚過敏和視力減退等病癥，帶來潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)[1]，因此建立季銨鹽類消毒劑的檢測方法尤為重要。

目前關(guān)于季銨鹽類消毒劑的檢測方法主要有毛細(xì)管電泳法[2]、離子色譜法[3]、液相色譜法[4-10]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11-12]和液相色譜-質(zhì)譜法[13-16]。前處理方法有直接提取法[17-18]、離子交換柱凈化法[19]和QuEChERS 凈化方法[20-22]。鹽析輔助均相液液萃取是一類相轉(zhuǎn)變分離技術(shù)，具有快速、操作簡單優(yōu)點(diǎn)。本文擬基于鹽析輔助均相液液萃取和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)建立一種測定嬰幼兒配方乳粉中14 種季銨鹽類消毒劑殘留的方法。為食品安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十二烷基二甲基芐基氯化銨、十四烷基二甲基芐基氯化銨、十六烷基二甲基芐基氯化銨、十八烷基二甲基芐基氯化銨、雙十烷基二甲基溴化銨、雙十二烷基二甲基溴化銨、雙十四烷基二甲基溴化銨、雙十六烷基二甲基溴化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨、芐索氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基溴化銨、四丁基硫酸氫銨（純度均不小于98%）購于日本TCI 公司。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）和乙酸銨（色譜純）購自德國Merck公司；無水硫酸鎂（分析純）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀配Shimadzu LC-30A 高效液相色譜儀、himadzu LCMS-8050 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，日本島津公司；BT 125D 電子天平，德國Sartorius 公司；MS3 型渦旋混合器，德國IKA 公司；SB-800DTD 超聲清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；Mili-Q 超純水機(jī)，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取14 種季銨鹽類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg（精確至0.01 mg）于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，分別配制成濃度為1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃避光冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確移取100 μL 的14 種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃冷藏保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備：用1.3.3 處理后的空白樣品提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制成適當(dāng)濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 儀器條件1.3.2.1 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI 源）；采集模式：正離子模式；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣流量為1.5 L/min；干燥氣流量為5.0 L/min；加熱氣流量為10.0 L/min；接口溫度為300 ℃；加熱塊溫度為500 ℃；CID 氣壓力為17 kPa。質(zhì)譜/質(zhì)譜測定參考條件如表1 所示。

表1 14 種消毒劑的質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（75 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸甲醇（含濃度10 mmol/L 乙酸銨）；流動(dòng)相B：0.1%甲酸水（含濃度10 mmol/L 乙酸銨）；流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為1 μL；柱溫40 ℃；洗脫方式：梯度洗脫如表2 所示。

表2 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的流動(dòng)相及梯度洗脫條件

1.3.3 樣品前處理

稱取1 g（精確至0.01 g）嬰幼兒配方乳粉于50 mL離心管中，加入2 mL 水溶液，渦旋混勻1 min，超聲15 min，加入8 mL 乙腈，渦旋混勻1 min，超聲15 min，加入2 g 無水硫酸鎂，震蕩30 min，轉(zhuǎn)速為8000 r/min離心5 min，取全部上清液至15 mL 離心管中，50 ℃氮吹濃縮至干，準(zhǔn)確加入0.5 mL 甲醇溶解殘?jiān)?，?jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 水量的優(yōu)化

嬰幼兒配方食品多是以乳基為主的固體食品，需要先用水將其溶解，再提取目標(biāo)化合物。對此我們考察了試樣質(zhì)量和水體積的比例（1∶1，1∶2，1∶5），發(fā)現(xiàn)1∶1 時(shí)有些樣品不能完全溶解，而當(dāng)比例為1∶5 時(shí)，在后續(xù)的凈化過程中，雙十八烷基二甲基溴化銨回收率低至3%，而采用1∶2 的比例時(shí)，樣品不僅能完全溶解，而且回收率提高至80%以上。故最終選擇1∶2 的比例。

2.1.2 鹽析輔助均相液液萃取(SHLLE)的優(yōu)化

SHLLE 在QuEChERS 前處理技術(shù)中應(yīng)用廣泛，其關(guān)鍵因素是在鹽析條件下，目標(biāo)物在水相和有機(jī)相（萃取劑）中的分配效率。本研究考察了不同的萃取劑（10%甲酸乙腈、乙腈、10%氨水乙腈）對14 種消毒劑的提取效率及基質(zhì)效應(yīng)的影響。如圖1 ，結(jié)果表明，不同的萃取劑對碳鏈相對短的化合物的提取效率幾乎無差別，但對于長鏈雙烷基季銨鹽差異較大。在堿性萃取劑下，當(dāng)雙烷基季銨鹽碳鏈增加時(shí)回收率明顯降低，如雙十二烷基二甲基溴化銨、雙十四烷基二甲基溴化銨、雙十六烷基二甲基溴化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨的回收率分別為91%，77%，59%，20%，而酸性和中性萃取劑下回收率較好。

圖1 14 種消毒劑在3 種萃取劑下的鹽析萃取回收率

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀器雖然具有液相優(yōu)異的分離度和質(zhì)譜較高的分辨力，但基質(zhì)效應(yīng)的存在經(jīng)常影響定量的準(zhǔn)確性和精密度。本文采取提取后添加法對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià)[36]，測定純?nèi)軇┡c空白基質(zhì)提取液中相同濃度水平下分析物的質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度，通過ME=B/A×100%公式計(jì)算得到二者相對比值來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。其中，ME 表示基質(zhì)效應(yīng)的大小，A 為純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積，B 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。ME 大于100%時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于100%時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，設(shè)置以80%～120%為基質(zhì)效應(yīng)可忽略。此種評價(jià)方式不僅可以對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行定量評價(jià)，而且可以比較不同方法的基質(zhì)效應(yīng)大小。為了考察不同萃取劑對14 種消毒劑的基質(zhì)效應(yīng)，用1.3.3 的前處理步驟制備的空白基質(zhì)溶液和定容溶劑分別稀釋14 種目標(biāo)化合物，得到相同濃度的測定液，采用相同的HPLC-MS/MS 方法測定，計(jì)算各自的峰面積。按照公式ME=B/A×100%計(jì)算。本文采用此評價(jià)方法考察了3 種萃取劑對14 種季銨鹽類消毒劑的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見圖2，在酸性萃取劑下十六烷基三甲基溴化銨（56%）、雙十六烷基二甲基溴化銨（78%）和雙十八烷基二甲基溴化銨（54%）三種消毒劑不在此范圍內(nèi)；而在中性和堿性萃取劑下只有雙十八烷基二甲基溴化銨的基質(zhì)效應(yīng)不在此范圍內(nèi)。從提取效率及基質(zhì)效應(yīng)綜合考察，最后選擇乙腈作為最終的萃取劑。

圖2 14 種消毒劑在3 種萃取劑下的基質(zhì)效應(yīng)

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

選用實(shí)驗(yàn)室常用的C18 色譜柱分析，由于季銨鹽類消毒劑多為長鏈烷基化合物，在C18 色譜柱上保留較強(qiáng)，而初始比例為80%有機(jī)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)四丁基硫酸氫銨保留弱（保留時(shí)間不到1 min），當(dāng)調(diào)至50%有機(jī)相時(shí)在1.5 min 后出峰，而對于保留較強(qiáng)的雙十八烷基二甲基溴化銨，需要100%有機(jī)相至少洗脫3 min 才可完全洗脫。為了洗脫掉更多雜質(zhì)而不影響后續(xù)的分析測定，最終采用100%有機(jī)相洗脫5 min。

本文首先嘗試以甲醇-水溶液、甲醇-10 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水（含10 mmol/L 乙酸銨）溶液實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除雙十四烷基二甲基溴化銨、雙十六烷基二甲基溴化銨、雙十八烷基二甲基溴化銨外，采用甲醇-0.1%甲酸水（含10 mmol/L 乙酸銨）溶液作為流動(dòng)相時(shí)，峰形最好、響應(yīng)值較高。當(dāng)有機(jī)相中添加0.1%甲酸（含10 mmol/L 乙酸銨時(shí)，需在100%有機(jī)相下才被洗脫的以上3 種極性較弱的化合物的峰形及響應(yīng)值才大幅提高，最終洗脫條件見表2，總離子流圖見圖3。

圖3 14 種消毒劑的總離子流(質(zhì)量濃度5 ng/mL)

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

季銨鹽類消毒劑是通過帶正電的氮原子鏈接4個(gè)官能團(tuán)的（R4N+）化合物，常與Cl，Br 等鹵族陰離子以鹽的形式存在。首先采用全掃描的模式，對化合物進(jìn)行全掃描，發(fā)現(xiàn)母離子都是失去鹵離子的R4N+離子；然后通過調(diào)節(jié)碰撞能對子離子進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)相同結(jié)構(gòu)的季銨鹽具有類似的碎片離子，3 種典型季銨鹽類消毒劑裂解圖及二級質(zhì)譜圖見圖4。如烷基二甲基芐基銨鹽都有芐基碎片（C6H5-CH2+，m/z= 91）、雙鏈烷基二甲基銨鹽和烷基三甲基銨鹽兩類鹽先是氮原子與長鏈烷基σ 鍵斷裂，形成[M-R+H]+離子和烷基自由基，然后烷基自由基經(jīng)過半異裂形成CnH2n+1系列峰簇，其中以C4H9+，m/z=57,響應(yīng)最高，其中烷基三甲基銨鹽的[M-R+H]+離子為(CH3）3NH+, m/z= 60）特征碎片。

圖4 3 類季銨鹽類消毒劑的代表性裂解圖及二級質(zhì)譜

2.4 方法的線性范圍、檢出限與定量限

將1.3.1 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液按濃度從低到高依次經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以目標(biāo)物定量離子的峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，14 種季銨鹽類消毒劑在2～200 ng /mL濃度范圍內(nèi)，各化合物相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好,見表3。

表3 14 種季銨鹽類消毒劑的線性回歸方程方程和相關(guān)系數(shù)

采用在空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法確定方法定量限，以對應(yīng)色譜峰響應(yīng)值3 倍信噪比的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，為0.5 μg/kg；以對應(yīng)色譜峰響應(yīng)值10 倍信噪比的質(zhì)量濃度作為方法定量限，為1.0 μg/kg。

2.5 方法回收率和精密度

稱取空白嬰幼兒配方奶粉分別加入低、中、高3 水平濃度為1 、5 μg/kg 和50 μg/kg 的加標(biāo)樣品，每一濃度平行測定6 次，按照本方法處理測定得到回收率及精密度，測定結(jié)果均具有良好的回收率及重現(xiàn)性，測定結(jié)果見表4。

表4 嬰幼兒配方奶粉中14 種季銨鹽類消毒劑的回收率與精密度(n=6)

2.6 樣品測定

對市售的10 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的30 個(gè)嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)十二烷基二甲基芐基氯化銨檢出率為27%，檢出值為1.5 ～80.0 μg/kg；十四烷基二甲基芐基氯化銨檢出率為33%，檢出值為1.3～61.1 μg/kg；十六烷基二甲基芐基氯化銨檢出率為23%，檢出值為1.1～5.6 μg/kg，其他未有檢出。但都未超過歐盟規(guī)定的上限值0.1 mg/kg。表5 結(jié)果表明，嬰幼兒配方奶粉中確實(shí)存在季銨鹽類消毒劑殘留，應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)監(jiān)管部門及生產(chǎn)企業(yè)的高度重視，完善相關(guān)的檢測及限量標(biāo)準(zhǔn)。

表5 實(shí)際樣品中14 種季銨鹽類消毒劑的檢測結(jié)果 μg/kg

(續(xù)表5)

3 結(jié)論

本文建立了以鹽析輔助均相液液萃取技術(shù)為基礎(chǔ)，同時(shí)測定嬰幼兒配方乳粉中14 種季銨類消毒劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。本方法操作簡單、快捷、通量大，并對其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證及實(shí)際樣品應(yīng)用，結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確度高，精密度好，基質(zhì)效應(yīng)低，適用于嬰幼兒配方乳粉中14 種季銨類消毒劑殘留的測定。不僅為建立相關(guān)檢驗(yàn)及限量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，而且為企業(yè)及相關(guān)監(jiān)督管理部門的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控提供有力的技術(shù)支撐。