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分步酶解制備乳清蛋白源ACE 抑制肽的工藝研究

2022-06-07 09:43:54范堯珠李倩茹王雪峰普岳紅李凌飛黃艾祥
中國(guó)乳品工業(yè) 2022年5期
關(guān)鍵詞:乳清木瓜抑制率

范堯珠,李倩茹,王雪峰,2,普岳紅,2,李凌飛,黃艾祥

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,昆明 650201;2.云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,昆明 650201)

0 引言

乳餅作為云南特色產(chǎn)品之一,其制作過程中會(huì)產(chǎn)生大量的乳清水,乳清水具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[1-4],但這些乳清水未得到充分利用,造成了浪費(fèi)。因此,如何提高乳清水的利用率成為亟待解決的問題。

高血壓是一種慢性疾病,如今,高血壓患者人數(shù)已突破1 億[5-8]。常見的高血壓藥物大多是化學(xué)合成的,具有一定的毒性,影響身體健康[9]。食品源血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)抑制肽是理想的高血壓治療藥物[10],且多項(xiàng)研究表明,乳蛋白源是ACE 抑制肽的一個(gè)重要來源[11-12]。

本研究以乳清水為原料,采用雙酶分步酶解乳清蛋白制備ACE 抑制肽,以蛋白水解度和ACE 抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最佳酶解條件,以期為乳源ACE 抑制劑的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HHL(馬尿酰-組氨酸-亮氨酰)、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶,上海源葉生物科技有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE),美國(guó)Sigma-Aldrich 試劑公司;木瓜蛋白酶,江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

H3-18K 臺(tái)式高速離心機(jī),湖南可成儀器設(shè)備有限公司;JC-SY 恒溫水浴鍋,上海成順儀器儀表有限公司;BSA124S-CW 電子天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;STARTER3100pH 計(jì),奧豪斯儀器(上海)有限公司;R-BIOPHARMWELI 酶標(biāo)儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳清蛋白粉的制備

原料的制備參照雷靜[13]的方法。

乳清水→用10 mo l/L 的NaOH 調(diào)pH 至7.5 →按照12 mL/L 的量添加濃度為1 mol/L 的CaCl2(目的是沉淀酪蛋白)→在60 ℃水浴攪拌15 min→離心(4000 r/min,4 ℃,35 min) →取上清液→粗濾→微濾→超濾→透析→凍干→乳清蛋白粉

1.2.2 乳清蛋白源ACE 抑制肽的酶解制備工藝流程

乳清蛋白粉→按照料液比加蒸餾水配成溶液→震蕩5 min→調(diào)到酶的最適pH→水浴酶解(酶解過程中保持酶解的pH 值)→95 ℃酶失活10 min→離心(4000 r/min,30 min)→酶解液

1.2.3 酶解產(chǎn)物水解度的測(cè)定

水解度參照呂小京等的OPA(鄰苯二甲醛)法[14]進(jìn)行測(cè)定。向96 孔板中依次加入酶解液和OPA 試劑,在25 ℃左右震蕩8 min 后,在340 nm 處測(cè)定吸光值。以GSH(谷胱甘肽)為標(biāo)準(zhǔn)品繪制肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn),將吸光度代入公式求出樣品中的多肽含量,蛋白含量用凱氏定氮法測(cè)定值為68.7%。水解度計(jì)算為

1.2.4 ACE 抑制率的測(cè)定

采用紫外分光光度法[15]。用pH 值為8.3,含濃度為0.3 mol/L 的NaCl(PBS)溶液將HHL 固體配置成濃度5 mmol/L 的溶液,首先把馬尿酸和酶解液混合在37 ℃條件下預(yù)熱5 min,然后加入標(biāo)品,在相同溫度下繼續(xù)反應(yīng)30 min,之后立馬加入鹽酸終止反應(yīng)。最后加入適量的乙酸乙酯提取反應(yīng)物中的馬尿酸。用離心機(jī)離心10 min,轉(zhuǎn)速為4000 r/min 后取300 μL上清液于另一離心管中,120 ℃烘干,取出冷卻到常溫后加入0.6 mL 超純水,在228 nm 處測(cè)定吸光度。ACE 抑制率為

式中:Aa為樣品組;Ab為對(duì)照組;Ac為提前終止反應(yīng)組。具體步驟如表1 所示。

表1 體外ACE 抑制率測(cè)定方法 μL

1.3 酶解條件

1.3.1 酶的篩選

酶具有專一性,酶的類別不一樣,獲得的酶解產(chǎn)物的特性不同。采用堿性、胃、胰和木瓜蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)水解度和ACE 抑制率,確定出最佳的兩種酶。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

在分解階段選擇了兩種酶,以溫度50 ℃,酶解時(shí)間2.5 h∶2.5 h,料液比1∶30 為初始條件,研究酶解溫度(40,45,50,55,60 ℃)、酶解時(shí)間(1 h∶4 h,2 h∶3 h,2.5 h∶2.5 h,3 h∶2 h,4 h∶1 h) 和料液比(1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50)對(duì)水解度和ACE 抑制活性的影響,確定出各個(gè)因素的最適條件。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果,運(yùn)用響應(yīng)面軟件進(jìn)性進(jìn)行了三因素三水平的設(shè)計(jì)來優(yōu)化工藝條件,得出酶解的最佳工藝條件,如表2 所示。

表2 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

由于不同蛋白酶作用底物的酶切位點(diǎn)及水解方式不同,酶解出來的片段的結(jié)構(gòu)和活性也不相同,因此,選取合適的蛋白酶是制備目標(biāo)肽的重要因素[16]。由圖1可知,水解度由大到小依次為堿性蛋白酶>木瓜蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶;ACE 抑制率也呈相同趨勢(shì),因此確定將堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同蛋白酶對(duì)水解度及ACE 抑制率的影響

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

以溫度50 ℃,酶解時(shí)間2.5 h∶2.5 h 為初始條件,探究料液比(1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50)對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 所示,隨著比例的不斷增大,ACE 抑制率和水解度所成趨勢(shì)大致相同。當(dāng)ACE 抑制率達(dá)到峰值(84.44%)時(shí),相應(yīng)的料液比為1∶30,隨著蒸餾水量的增加,降壓活性和水解度呈下降的趨勢(shì),ACE 抑制率和水解度呈向下降的趨勢(shì),這可能是因?yàn)橹参锏鞍字泻兄参锏鞍酌敢种苿?,能與蛋白酶作用與底物共享蛋白酶的結(jié)合基團(tuán),表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用[17],因此可以確定酶解的最佳料液比為1∶30。

圖2 料液比對(duì)乳清蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

以酶解溫度50 ℃,料液比1:30 為初始條件,探究酶解時(shí)間(1 h∶4 h,2 h∶3 h,2.5 h∶2.5 h,3 h∶2 h,4 h∶1 h)對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3 所示。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)乳清蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

實(shí)驗(yàn)采用堿性蛋白酶先酶解一段時(shí)間后再加入木瓜蛋白酶的順序進(jìn)行分步酶解,由圖3 可知,ACE 抑制率先升高后降低,酶解時(shí)間(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)為3∶2 時(shí),ACE 抑制率達(dá)到峰值87.9%,這時(shí)的水解度也比較高。當(dāng)酶解時(shí)間大于3∶2 時(shí),活性肽鏈被過度酶降解,結(jié)構(gòu)被破壞,并且酶產(chǎn)物的抑制活性降低[18]。因此,可以初步確定最佳的酶解時(shí)間(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)為3∶2。

2.2.3 酶解溫度對(duì)水解度及ACE 抑制率的影響

以料液比1∶30,酶解時(shí)間2.5 h∶2.5 h 為初始條件,探究酶解溫度(40,45,50,55,60 ℃)對(duì)酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 可知,抑制活性和酶解程度的變化趨勢(shì)相似。當(dāng)溫度為50 ℃時(shí),水解度和抑制活性最好,隨著溫度的升高,抑制活性和水解度下降,因?yàn)槊糠N酶都有特定的耐受溫度值,當(dāng)溫度超過了它原本所能承受的溫度時(shí),酶的活性反而會(huì)受到抑制而降低,影響了酶促水解的速率[19],由此可以確定50 ℃為最適的酶解溫度。王晟等[20]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶制備山杏源降糖肽的最佳酶解溫度為50 ℃,與本研究相似。

圖4 酶解溫度對(duì)乳清蛋白酶解產(chǎn)物水解度及ACE 抑制率的影響

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在篩酶試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)乳清蛋白進(jìn)行分步酶解,酶的添加量為4%,根據(jù)響應(yīng)面Box-Benhnken 原理,選取料液比、酶解時(shí)間和酶解溫度為考查因素,ACE 抑制率(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示,方差分析如表4 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 回歸模型與方差分析

所得數(shù)據(jù)通過DesignExpert8.0.6 軟件逐步回歸分析,得到ACE 抑制率與溫度、時(shí)間和料液比擬合后的二次多項(xiàng)回歸方程為

由表4 可知,該模型P<0.0001,說明分布酶解乳清蛋白制備ACE 抑制肽回歸模型顯著,同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著,R2=0.97 表示模型可信度高,可用該模型來分析和預(yù)測(cè)整體實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表4 中X1、X2、X3的F 值大小可以推斷出,3 個(gè)因素對(duì)酶水解產(chǎn)物抑制活性的影響順序?yàn)閄1>X2>X3,即料液比>酶解時(shí)間>酶解溫度,其中X1和X2的影響對(duì)于ACE 抑制率更為重要。ACE 抑制率與各因素呈明顯的線性關(guān)系,通過分析可以得到酶解過程的最佳參數(shù)。

分析料液比(X1)、酶解時(shí)間(X2)、酶解溫度(X3)對(duì)ACE 活性的影響情況,3 個(gè)因素之間兩兩交互作用下的三維圖和等高線如圖5 所示。

圖5 各因素及交互作用對(duì)ACE 抑制率的影響

通過DesignExpert8.0.6 軟件分析及預(yù)測(cè),得到最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間3∶2,料液比1∶35(g/mL),在此參數(shù)條件下所得酶解產(chǎn)物的ACE抑制率達(dá)到88%,與預(yù)測(cè)值87.69%接近。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以從云南乳餅加工副產(chǎn)物—乳清水中獲得的乳清蛋白粉為原料,采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化了分步酶解乳清蛋白制備ACE 抑制肽的工藝,獲得其最佳酶解條件為溫度50 ℃,時(shí)間(堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)3∶2,料液比1∶35(g/mL),在此條件下酶解液的ACE 抑制率為88%。研究可為后續(xù)乳清蛋白源ACE 抑制肽的進(jìn)一步分離鑒定奠定基礎(chǔ),為相關(guān)功能性食品的開發(fā)提供重要參考。

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