頓彩虹,白愛紅,謝文燕,戚靜宜

1.漯河市婦幼保健院生殖遺傳科,漯河 462000;2.洛陽市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學科,洛陽 471699

排卵障礙是女性不孕的重要原因之一,占25%～40%,表現(xiàn)為肥胖、多毛、功能失調性子宮出血、閉經(jīng)等癥狀,并顯著增加乳腺癌、子宮內膜癌等風險[1-2]。中醫(yī)諸多先賢指出肝在女性生殖中起關鍵性作用,在月經(jīng)紊亂、不孕癥治療上多從肝調治,疏肝法亦被證實療效顯著[3-4]。白芍苦酸微寒,可養(yǎng)血調經(jīng)、柔肝止痛、平抑肝陽,是多種助孕方劑中的常用組方,白芍總苷為白芍的主要成分,具有抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝、抑制自身免疫反應等多種藥理活性[5],李賽等[6]證明白芍在促卵泡發(fā)育、促排卵方面有一定作用。TGF-β1/Smads信號轉導通路在卵泡發(fā)育期間發(fā)揮重要作用,轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)在卵巢不同發(fā)育階段均有表達,可通過旁分泌或自分泌機制參與卵巢卵母細胞成熟、顆粒細胞增殖等生理過程,調節(jié)多種關鍵顆粒細胞酶,在維持卵巢良好內環(huán)境中扮演重要角色。本研究通過建立排卵障礙大鼠模型,觀察白芍總苷干預效果,并探討其相關機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Varioskan LUX型酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司);RM2265型病理切片機(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥

白芍總苷(國藥準字H20055058,寧波立華制藥有限公司);TGF-β1/Smads通路抑制劑SB431542(質量分數(shù)>99%,美國Abcam公司);羥基脲(國藥準字H11020569;0.25 g,北京永正制藥有限責任公司);促黃體素(lutropin,LH),卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH),雌二醇(estradiol,E2)放射免疫分析試劑盒(上海谷研實業(yè)有限公司);抗米勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)酶聯(lián)免疫試劑盒(上?？吕咨锟萍加邢薰?;TGF-β1、Smad4、Smad3、p-Smad3一抗(美國Santa Cruz公司)。

1.3 動物

70只SPF級SD雌性大鼠,未交配,60日齡,體質量(230±20) g,購自安泰康生物技術(北京)有限公司,使用許可證號SYXK(京)2019-0047。在室溫22～24 ℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境中飼養(yǎng),光照、黑暗12 h交替,自由飲食、飲水。適應性喂養(yǎng)1周,每天早上8點觀察陰道分泌物涂片,其中有規(guī)律動情周期的有60只,納入后續(xù)實驗。

2 方法

2.1 模型建立與分組

60只大鼠隨機抽取10只作為健康組,其余50只建立排卵障礙模型。模型組連續(xù)11 d根據(jù)體質量用羥基脲懸濁液0.01 mL·g-1灌胃,健康組連續(xù)11 d灌胃等量生理鹽水。從灌胃第7天開始做陰道分泌物涂片,連續(xù)2個周期。健康組動情周期4～5 d,建模大鼠動情周期紊亂,推遲7～9 d甚至消失,停滯在動情間期[7]。40只大鼠動物周期消失,納入后續(xù)實驗,隨機分為排卵障礙組、抑制劑組、白芍總苷組、抑制劑+白芍總苷組,各10只。

2.2 干預方式

建模成功后,抑制劑組以SB431542 5 mg·kg-1腹腔注射;白芍總苷組以白芍總苷200 mg·kg-1灌胃;抑制劑+白芍總苷組采用SB431542及白芍總苷干預,用法及用量同抑制劑組、白芍總苷組;健康組、排卵障礙組與抑制劑組用等體積生理鹽水腹腔注射,與白芍總苷組等體積生理鹽水灌胃。1日1次,連續(xù)干預4周。

2.2.1組織取材 動情期間禁食不禁水24 h,戊巴比妥鈉腹腔麻醉,腹主動脈取血8～10 mL,靜置30 min,以3 500 r·min-1離心15 min,分離血清保存于-80 ℃?zhèn)溆?血液采集完成后,斷頭處死大鼠,解剖、分離卵巢,清除周圍脂肪,用預冷生理鹽水沖洗,分為2份,1份用質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定,1份保存于液氮中。

2.2.2檢測血清性激素、AMH水平 取冷凍保存血清,采用雙抗體放射免疫法檢測血清LH、FSH和E2水平;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清AMH水平,嚴格按照試劑盒說明書要求設計檢測流程,用酶標儀測定570 nm處的吸光度值,以對照品質量濃度為橫坐標(x)、吸光度為縱軸坐標(y)繪制標準曲線,根據(jù)標準曲線計算AMH水平。

2.2.3HE染色觀察卵巢形態(tài)學變化 取用質量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛固定的卵巢組織,自動脫水機脫水、透明和浸蠟,56 ℃石蠟包埋,冷凍30 min后制成4 μm連續(xù)切片。HE染色后用中性樹膠封片,于光學顯微鏡下觀察卵巢形態(tài)學變化,并隨機選取5個不相鄰的視野,計單側卵巢中的成熟卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)。

2.2.4卵巢組織TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的表達水平 取保存于液氮中的卵巢組織,提取蛋白,用BCA試劑盒定量、配平。取40 μg卵巢組織蛋白樣品加入上樣緩沖液,置于100 ℃水浴5 min,離心取上清,恒壓下電泳后以濕轉法轉至硝酸纖維素膜上,加入封閉液封閉2 h,加入兔抗大鼠TGF-β1(1∶400)、Smad4(1∶200)、Smad3和p-Smad3(1∶200)一抗,置于4 ℃搖床上孵育過夜,用TBST充分洗膜,加入山羊抗兔IgG二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,用TBST充分洗膜,加入ECL顯色劑于暗室中曝光,用凝膠成像系統(tǒng)進行分析,以待測蛋白/內參GAPDH灰度值表示蛋白的相對表達量。重復3次取平均值。

2.3 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 一般情況

健康組大鼠皮毛光滑,飲食、活動量正常,對外界刺激警覺。排卵障礙組皮毛稀松、無光澤,進食量、活動量減少,倦怠,體質量無增加甚至減輕,抑制劑組更為嚴重。白芍總苷組、抑制劑+白芍總苷組干預后癥狀有所好轉,其中白芍總苷組的改善更為明顯。

3.2 血清性激素、AMH水平比較

與健康組比較,排卵障礙組血清LH、FSH、E2和AMH的水平均降低;抑制劑組、排卵障礙組、抑制劑+白芍總苷組、白芍總苷組血清LH、FSH、E2和AMH的水平依次升高(P<0.05)。結果見表1。

表1 各組血清性激素、AMH水平比較

3.3 排卵功能比較

與健康組比較,排卵障礙組成熟卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)和黃體數(shù)減少;抑制劑組、排卵障礙組、抑制劑+白芍總苷組和白芍總苷組成熟卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)和黃體數(shù)依次增加(P<0.05)。結果見表2。

表2 各組排卵功能比較

3.4 各組卵巢組織形態(tài)學變化

健康組可觀察到較多始基和差異發(fā)育卵泡;排卵障礙組卵巢組織中黃體和差異發(fā)育卵泡的數(shù)量明顯減少,可觀察到較多囊狀擴張卵泡,卵泡中顆粒細胞層數(shù)消失或明顯減少;抑制劑組的變化更為明顯;抑制劑+白芍總苷組、白芍總苷組始基卵泡、初級卵泡及黃體數(shù)量增加,白芍總苷組的改善更為明顯。結果見圖1。

注:A.健康組;B.排卵障礙組;C.抑制劑組;D.白芍總苷組;E.抑制劑+白芍總苷組。

3.5 排卵障礙組蛋白的表達水平

與健康組比較,排卵障礙組TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的相對表達量降低;抑制劑組、排卵障礙組、抑制劑+白芍總苷組、白芍總苷組TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的相對表達量依次升高(P<0.05)。結果見表3和圖3。

表3 各組TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白表達水平比較

圖2 Western blot檢測TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的表達水平

4 討論

下丘腦-垂體-卵巢軸是嚴格控制女性生殖的調控系統(tǒng),該軸中的任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生器質性病變或功能失調,均可引發(fā)排卵障礙[8-9]。排卵障礙即為卵泡不能發(fā)育成熟或成熟后不能排出,其主要病因包括下丘腦性無排卵、垂體功能障礙、卵巢性無排卵及甲狀腺、腎上腺功能失調。中醫(yī)在女性不孕治療方面積累了大量經(jīng)驗,肝調暢氣機、主疏泄,是沖任二脈陰陽消長轉化,卵子發(fā)育、成熟且順利排出的關鍵樞機[10]。白芍入肝脾血分,在古方與現(xiàn)代組方中通常作為配伍藥物參與排卵障礙疾病的治療。然而,中藥組方對排卵障礙的治療作用是通過多環(huán)節(jié)、多途徑及多靶點來實現(xiàn)的,研究單味藥物或中藥單體,更有利于中醫(yī)藥有效成分的定性、定量,便于臨床推廣。因此,本課題組選用白芍總苷,研究其對排卵障礙的治療作用及可能的機制。

中醫(yī)認為[11],腎-天葵-沖任-胞宮生殖軸的平衡、協(xié)調是調節(jié)女子生殖系統(tǒng)的重要樞紐。腎氣足、天葵至、沖任通盛,則月經(jīng)規(guī)律,可孕子。腎之開合,不僅與腎陽相關,而且與肝疏泄功能具有密切關系。肝主氣機,自古就有學者認為“女子以肝為先天”,肝為剛臟,如肝氣郁結、疏泄不利,則無法將腎所產(chǎn)生的成熟卵子規(guī)律地疏泄出,導致排卵功能障礙[12]。白芍是常用的養(yǎng)血調經(jīng)、平抑肝陽的中藥,通常用于女性月經(jīng)不調、經(jīng)孕帶產(chǎn)等病癥的治療。白芍總苷是白芍的藥效成分單體,具有鎮(zhèn)靜,鎮(zhèn)痛,抗驚厥,抗炎,調節(jié)免疫系統(tǒng),保護肝臟、腎臟等多種藥理活性[13]。隨著對中藥單體研究的逐漸深入,白芍總苷在生殖系統(tǒng)疾病治療中的作用逐漸受到關注。現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)[14],白芍總苷可通過調節(jié)神經(jīng)、內分泌、免疫系統(tǒng)提升機體整體機能,并作用于卵巢,影響睪酮與E2合成過程中17-β甾酮氧化還原酶及芳香化酶等的活性,抑制睪酮分解,促進E2合成從而誘發(fā)排卵。本研究結果顯示,與排卵障礙組比較,白芍總苷組血清LH、FSH、E2、AMH水平升高,成熟卵泡數(shù)、生長卵泡數(shù)、黃體數(shù)增加,卵巢組織中始基卵泡、初級卵泡及黃體數(shù)量增加,提示白芍總苷可提高排卵障礙大鼠性激素及AMH水平,改善排卵功能。

卵泡的生長、發(fā)育、成熟、排出過程十分復雜,受多種自分泌、旁分泌因子的調控,其中卵巢局部的TGF-β1/Smads通路備受關注,該通路在卵巢分化、演變,以及卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β1是一種涉及細胞生長、分化及組織修復等過程的多功能細胞因子。有學者提出[15],TGF-β1參與卵巢局部調節(jié),介導E2刺激卵巢顆粒細胞、竇前期卵泡顆粒細胞DNA合成,促進血清雌激素水平升高以改善排卵。Smads蛋白家族是目前唯一被證實的TGF-β1受體作用底物,顯著表達于哺乳動物卵巢,同時介導TGF-β超家族在卵泡發(fā)育及排卵中的作用[16]。Smad3作為Smads家族中受體調節(jié)型蛋白,階段特定性表達于卵泡顆粒細胞中,通過磷酸化作用發(fā)揮生物學效應[17]。Smad4是Smads家族中的通用型蛋白,通過與活化的Smad3形成復合物,轉移至細胞核,協(xié)同其他轉錄因子對TGF-β1應答基因轉錄進行調節(jié)[18-19]。本研究中,與排卵障礙組比較,抑制劑組、排卵障礙組、抑制劑+白芍總苷組、白芍總苷組TGF-β1、Smad4、Smad3和p-Smad3蛋白的相對表達量依次升高,表明TGF-β1/Smads通路抑制劑的使用可削弱白芍總苷對排卵障礙的治療作用,且TGF-β1/Smads通路被抑制可能引起排卵障礙,白芍總苷可能通過激活該通路發(fā)揮治療作用。孫玉英等[20]的研究表明,對于卵巢儲備功能下降大鼠,上調其卵巢中TGF-β1/Smads通路,可增強卵巢儲備功能,改善促排卵效果,本研究的結果與之高度一致。

綜上所述,白芍總苷可提高排卵障礙大鼠性激素、AMH水平,改善排卵功能、卵巢組織形態(tài)學變化,該作用可能通過激活TGF-β1/Smads通路實現(xiàn)。