竇 晨,趙聲蘭,丁 雄,林柳任,馬云淑,潘 蕊,程 欣

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 云南省高校外用給藥系統(tǒng)與制劑技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500

葡萄籽、葡萄皮作為葡萄酒釀造過(guò)程中的邊腳料常被作為廢棄物丟棄,但這些廢棄物中含有豐富的多酚,可作為一種生態(tài)可持續(xù)和低成本的天然抗氧化劑來(lái)源。其中葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)由于含量高、活性好,具有抗癌[1]、抗菌[2]、抗氧化清除自由基[3]、抗炎[4]、抑制黑色素的生成[5]等藥理學(xué)活性,受到了研究者們的廣泛關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn),與維生素C和維生素E琥珀酸酯相比,GSP是更有效的抗氧化劑和自由基清除劑[6],萄萄籽中多酚類物質(zhì)的含量可達(dá)5%～8%,在這些多酚類物質(zhì)中,以原花青素含量最高。GSP主要是由兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯聚合而成的二聚體及多聚體[7]。隨著聚合度不同表現(xiàn)出不同的理化性質(zhì),低聚原花青素有較強(qiáng)的抗氧化活性,顏色呈白色或淺黃色。高聚原花青素主要是原花青素縮合后的產(chǎn)物,顏色呈紅色,水溶性較差,抗氧化活性比低聚體低,常用作染色劑、食品著色劑[8]。由于GSP分子結(jié)構(gòu)中的不飽和鍵和強(qiáng)大的抗氧化能力使其易受光、熱、酶、金屬離子、氧氣和酸堿度的影響變得極不穩(wěn)定[9];并且由于其水溶性小,導(dǎo)致生物利用度降低;其具有澀味和苦味,這些性質(zhì)限制了原花青素在食品、藥品、化妝品領(lǐng)域的廣泛使用。

脂質(zhì)體是具有磷脂雙分子層的封閉囊泡狀結(jié)構(gòu),主要由磷脂或磷脂分子組成,能夠包載具有不同性質(zhì)(如親水性、親脂性和兩親性)的藥物分子,從而增加被包封藥物分子的穩(wěn)定性和功能性,增大藥物的溶解度,提高藥物的穩(wěn)定性。傳統(tǒng)的囊泡體(脂質(zhì)體和囊泡)不能有效地通過(guò)皮膚進(jìn)行透皮傳遞,而是局限在皮膚的表層,因此添加丙二醇、膽酸鈉作為邊緣活化劑的柔性納米脂質(zhì)體,由于其具有柔韌性和可變形性,故更容易進(jìn)行透皮傳遞[10-11]。本實(shí)驗(yàn)采用薄膜分散超聲法[12]制備GSP-LPs,用響應(yīng)曲面法對(duì)其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,考察其體外釋放特性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用GSP奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JEM-1400PLUS型透射電子顯微鏡、Brookhaven 190Plus型納米激光粒度儀均購(gòu)自美國(guó)布魯克海文公司;電子天平(奧斯豪儀器有限公司);臺(tái)式高速大容量冷凍離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海翱藝儀器有限公司);TK-12B型透皮擴(kuò)散池(上海市鍇凱科技貿(mào)易有限公司);FS-300N型超聲波處理器(上海生析超聲儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(昆明倍捷科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予化儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥

原花青素對(duì)照品(批號(hào)1024K021SX,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%,北京索萊寶科技有限公司);葡萄籽原花青素(批號(hào)002200604028,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%,天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開(kāi)發(fā)有限公司);大豆卵磷脂(批號(hào)1112J021,北京索萊寶科技有限公司);膽固醇(批號(hào)624J033),脫氧膽酸鈉(批號(hào)909P021,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)均購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司;香草醛(批號(hào)C10083717,上海麥克林生化科技有限公司);鹽酸(批號(hào)20150518)、三氯甲烷(批號(hào)20150610)均購(gòu)自云南楊林工業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)汕滇藥業(yè)有限公司;甲醇(批號(hào)20201014,分析純,天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司);1,2-丙二醇(批號(hào)C10561784,上海麥克林生化科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠,雄性,體質(zhì)量(20±2) g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,許可證號(hào)SCXK(湘)k2017-0005。

2 方法與結(jié)果

2.1 香草醛鹽酸顯色法測(cè)定原花青素含量

2.1.1香草醛鹽酸顯色法實(shí)驗(yàn)原理 基于酚醛縮合反應(yīng),原花青素分子中的間苯三酚在酸催化下與香草醛(香蘭素C8H8O3)發(fā)生縮合而形成有色的碳正離子,使原花青素分子產(chǎn)生紅色的發(fā)光基團(tuán)[13](λ=500 nm)。原花青素或(+)-兒茶素可作為對(duì)照品。(+)-兒茶素或(-)-表兒茶素單體及其低聚體等都能參加反應(yīng),可同時(shí)測(cè)定單體和聚合體的總含量。

2.1.2顯色劑的配制 精密稱定2 g香草醛置于50 mL量瓶中,加入甲醇溶解,定容至50 mL,再加入1.5 mL鹽酸,混勻,即得。

2.1.3最大吸收波長(zhǎng)的確定[14]配制一定質(zhì)量濃度的原花青素對(duì)照品的甲醇溶液,取0.5 mL,置于試管中,加入3 mL香草醛甲醇溶液及1.5 mL鹽酸,搖勻,于20 ℃恒溫水浴中避光反應(yīng)15 min后,以試劑為空白對(duì)照溶液,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～800 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果顯示,其在500 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。見(jiàn)圖1。

注:a.GSP甲醇溶液的吸收峰;b.甲醇溶液的吸收峰。

2.2 測(cè)定原花青素含量紫外分光光度法的建立

2.2.1線性關(guān)系考察 精密稱定葡萄籽原花青素對(duì)照品5.36 mg,加入甲醇定容至10 mL,梯度稀釋配制成質(zhì)量濃度為0.05～0.46 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別精密量取0.5 mL不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液置于試管中,分別精密量取3 mL體積分?jǐn)?shù)為4%的香草醛甲醇溶液及1.5 mL鹽酸加入試管中,充分搖勻,于20 ℃水浴中反應(yīng)15 min后,于500 nm處測(cè)定其吸光度值,繪制吸光度-質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。數(shù)據(jù)分析后擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.997x+0.014 7(R2=0.999 4)。表明原花青素質(zhì)量濃度在0.05～0.45 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2精密度實(shí)驗(yàn) 配制質(zhì)量濃度分別為0.5、0.25、0.125 mg·mL-1的葡萄籽原花青素樣品溶液,連續(xù)6次測(cè)定其吸光度值,平均吸光度值分別為0.642、0.313、0.155,RSD值分別為0.14%、0.24%、0.33%。表明儀器的精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取1 mL 2.3.1項(xiàng)下制備的葡萄籽原花青素柔質(zhì)體,加入一定量的甲醇超聲破乳后靜置至上清液澄清,用同法處理的空白脂質(zhì)體調(diào)零,分別于0、2、4、6、8、12 h測(cè)定其在500 nm處的吸光度值,吸光度值分別為0.663、0.668、0.664、0.678、0.666、0.668,RSD值為0.84%。表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4加樣回收率實(shí)驗(yàn) 配制質(zhì)量濃度分別為0.69、1.45、2.17 mg·mL-1的葡萄籽原花青素對(duì)照品溶液,取1 mL空白脂質(zhì)體3份分別加入2 mL不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液,再分別加入一定量的甲醇超聲破乳后,取澄清上清液0.5 mL。根據(jù)2.2.1項(xiàng)下的方法測(cè)定其吸光度值(A),根據(jù)回歸方程計(jì)算得藥物含量(m)。加樣回收率=(加入量/測(cè)得量)×100%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 GSP-LPs的制備

2.3.1薄膜分散超聲法制備葡萄籽原花青素柔質(zhì)體 精密稱取處方量的卵磷脂、膽固醇溶于15 mL氯仿,脫氧膽酸鈉置于5 mL甲醇中超聲溶解。將上述2個(gè)組分置于圓底燒瓶中混合均勻,于40 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑,直至在瓶壁形成透明、干燥、均勻的脂質(zhì)薄膜。精密稱取處方量葡萄籽原花青素溶于6 mL水中,作為水相,將水相置于圓底燒瓶中,于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)水合30 min,將所得混合液置于超聲波處理器中,超聲混勻(150～180 W,5 min),用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾即得,置于4 ℃密封保存。

2.3.2包封率、載藥量測(cè)定方法 精密量取1 mL 2.3.1項(xiàng)下制備的柔質(zhì)體,加入1.2 mL 1 mol·mL-1鹽酸溶液靜置使其絮凝[15-16],以18 000 r·min-1離心20 min后,取上清液,以溶劑調(diào)零,測(cè)定上清液的吸光度值(A1)。另精密量取1 mL柔質(zhì)體,加入甲醇超聲使其破乳后靜置至上清液澄清,棄去底部白色絮狀沉淀,用同法處理的空白脂質(zhì)體調(diào)零,測(cè)定吸光度值(A2)。將A1、A2帶入2.2.1項(xiàng)下的回歸方程,計(jì)算出游離藥物含量M1及總藥量M總,脂質(zhì)體總質(zhì)量記為M2,根據(jù)公式計(jì)算出脂質(zhì)體的包封率和載藥量。包封率(EE)=[(M總-M1)/M總]×100%。載藥量=[(M總-M1)/M2]×100%。

2.3.3處方工藝優(yōu)選 通過(guò)查閱文獻(xiàn)及單因素實(shí)驗(yàn)[17],確立了對(duì)脂質(zhì)體包封率影響比較顯著的3個(gè)因素,即卵磷脂的質(zhì)量濃度(x1)、卵磷脂與膽固醇的比(x2)、膽酸鈉的用量(x3),將其作為響應(yīng)面的3個(gè)因素,并將包封率(y1)、粒徑(y2)、PDI(y3)作為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

據(jù)《后漢書(shū)》《三國(guó)志》載，陶謙與曹操對(duì)戰(zhàn)地點(diǎn)是在徐州，治所后來(lái)遷到山東郯城；陶謙死后，劉備接任徐州牧?xí)r，治所應(yīng)已移至下邳，因?yàn)閰尾际菑膭涫种袏Z了下邳，并自封徐州刺史，治所就在下邳。直到魏明帝時(shí)，徐州刺史部治所才移到彭城（徐州）。但《三國(guó)演義》中，說(shuō)劉備、呂布的治所都是在徐州，這樣，為了解釋呂布何以是在下邳被縊死，就不得不添補(bǔ)一些情節(jié)?！度龂?guó)演義》作者被認(rèn)為是明朝吳貫中；明洪武年間，下邳縣已屬邳州，并另建新城，古下邳城的重要性大大降低。吳貫中不知是誤會(huì)，還是有意，將戰(zhàn)爭(zhēng)重心移到了徐州，這與歷史不符。

表2 GSP-LPs優(yōu)選的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)各指標(biāo)的擬合方程,固定一個(gè)因素水平,用Design-Expert 8.0.6軟件分別繪制各評(píng)價(jià)指標(biāo)與另外2個(gè)考察因素的三維曲面圖,見(jiàn)圖2。根據(jù)響應(yīng)曲面擬合結(jié)果得最優(yōu)處方為x1=12.5 mg·mL-1,x2=15∶1,x3=15 mg。根據(jù)該優(yōu)化處方制備5批樣品,結(jié)果包封率為70.79%±0.02%,載藥量為1.16%±0.01%,PDI為0.26±0.01,與預(yù)測(cè)值(包封率70.25%,PDI=0.224)比較,偏差均<5%。實(shí)測(cè)粒徑為(156.47±7.03) nm,雖然與預(yù)期粒徑(167.43 nm)存在一定差別,但保持著較小的粒徑范圍。說(shuō)明擬合方程所建立的模型具有良好的預(yù)測(cè)性,工藝穩(wěn)定、可行。

圖2 各因素對(duì)GSP-LPs的PDI、包封率和粒徑影響的三維響應(yīng)曲面圖

2.3.4GSP-LPs的粒徑及Zeta電位檢測(cè) 取適量制備的GSP-LPs混懸液,加適量水稀釋后,用激光粒度儀測(cè)定其粒徑、PDI及Zeta電位。葡萄籽原花青素柔質(zhì)體的粒徑為(156.47±7.03) nm,PDI為(0.26±0.01),電位為(-42.35±4.00) mV (n=5),制得的柔質(zhì)體粒徑分布均勻,且集中分布于100～150 nm范圍內(nèi),穩(wěn)定性良好。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注:A.GSP-LPs的Zeta電位;B.粒徑分布。

2.3.5GSP-LPs的外觀及形態(tài)觀察 將2.3.1項(xiàng)下制備的空白柔質(zhì)體(blank flexiblenano-liposomes,B-LPs)及GSP-LPs混懸液置于透明西林瓶中,觀察其外觀,葡萄籽原花青素柔質(zhì)體為紅棕色乳液。吸取1滴柔質(zhì)體混懸液置于載玻片上,將銅網(wǎng)倒扣于液體上,用醋酸鈾對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)染,待樣品晾干后,在TEM透射電鏡下進(jìn)行觀察。結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn),柔質(zhì)體形態(tài)為類圓球形且分布均勻。

注:A.GSP-LPs透射電鏡圖(×80 000);B.GSP-LPs的外觀。

2.4 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

2.4.1離體小鼠皮膚的制備 將昆明種小鼠脫頸椎處死后,固定于木板上,用剃須機(jī)小心剔除腹部毛,立即剪下其腹部皮膚,剝離皮下組織及脂肪,將其浸泡于生理鹽水中,選取表皮完整無(wú)破損的皮膚置于-80 ℃保存,備用。

2.4.2經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn) 采用Franz透皮擴(kuò)散池法,以游離GSP為對(duì)照進(jìn)行GSP-LPs體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)。首先將預(yù)處理好的鼠皮固定于透皮杯上,使角質(zhì)層面向供給池,用夾子夾緊。再加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液-生理鹽水,將其作為接收介質(zhì)并排出氣泡,于水浴溫度(32±0.5) ℃、轉(zhuǎn)速300 r·min-1的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別于0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72 h取樣2 mL,同時(shí)補(bǔ)加等量同溫度的接收介質(zhì)。最后將接收液用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后,計(jì)算原花青素在不同時(shí)間點(diǎn)單位面積的累積透過(guò)量(Q),以時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)(x)、單位面積的累積透過(guò)量(Q)為縱坐標(biāo)(y)做圖。結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 GSP、GSP-LPs藥物單位面積累積透過(guò)量曲線

分別采用零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程、Weibull方程、Ritger-peppas方程對(duì)體外釋放結(jié)果進(jìn)行擬合。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示,以Weibull方程擬合時(shí)GSP、GSP-LPs均具有較高的擬合度,其相關(guān)系數(shù)分別為0.998 4、0.997 5,表明二者的釋放規(guī)律符合Weibull方程。

表3 GSP、GSP-LPs藥物單位面積累積透過(guò)量曲線方程擬合

2.4.3藥物的體外釋放考察 精密量取葡萄籽原花青素柔質(zhì)體、原花青素溶液2 mL,置于透析袋(相對(duì)分子質(zhì)量100 000)中,以8 mL體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液-生理鹽水為釋放介質(zhì),于Franz體外透皮擴(kuò)散池上以300 r·min-1的轉(zhuǎn)速恒溫(37±0.5) ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別于0.5、2、4、6、8、12、24、48、72、96 h取樣2 mL,同時(shí)補(bǔ)加等量同溫度的釋放介質(zhì),接收液用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾后,取0.5 mL于500 nm處測(cè)定藥物的吸光度值,計(jì)算藥物的累積釋放量。

累積釋放率=累積釋放量/投藥量。

以時(shí)間為橫坐標(biāo)(x)、藥物累積釋放率為縱坐標(biāo)(y)作圖,結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 GSP、GSP-LPs藥物累積釋放率曲線

分別采用零級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)釋放動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程、Weibull方程、Ritger-peppas方程對(duì)體外釋放結(jié)果進(jìn)行擬合。結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,以Weibull方程擬合時(shí)GSP、GSP-LPs均具有較高的擬合度,其相關(guān)系數(shù)分別為0.998 9、0.998 1,表明二者的釋放規(guī)律均符合Weibull方程。

表4 GSP、GSP-LPs藥物累積釋放率曲線方程擬合

3 討論

葡萄籽原花青素由于具有清除自由基、抗氧化活性而成為具有開(kāi)發(fā)潛力的天然抗氧化劑來(lái)源。通過(guò)劑型設(shè)計(jì)可以減少藥物自身存在的缺點(diǎn),增加藥物的生物利用度,使葡萄籽原花青素得到進(jìn)一步開(kāi)發(fā)、利用。將GSP包載于脂質(zhì)體后可以增加其溶解度、提高其穩(wěn)定性,有利于將其開(kāi)發(fā)為緩控釋制劑。有研究表明,由于原花青素的抗氧化效果,將其包載于脂質(zhì)體可以減少磷脂雙分子層的氧化,同時(shí)可以增加藥物的穩(wěn)定性[18],并且能夠掩蓋葡萄籽原花青素的苦味和澀味,可作為食品和飲料工業(yè)中的抗氧化劑[19],使其具有廣泛的應(yīng)用前景。

在本研究中采用脫氧膽酸鈉作為膜軟化劑制備脂質(zhì)體,將脫氧膽酸鈉溶于有機(jī)系,能夠大大縮短制備過(guò)程中的膜洗脫時(shí)間,增大脂質(zhì)體的包封率。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),GSP-LPs的粒徑會(huì)隨膽固醇用量的增加逐漸變大,另外延長(zhǎng)超聲時(shí)間、增大超聲功率可以顯著減小其粒徑,但仍需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化GSP-LPs的制備工藝,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。透皮釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其釋放符合Weibull釋放規(guī)律。與游離的藥物相比,GSP-LPs顯著延長(zhǎng)了藥物的釋放時(shí)間,有望將其制備為緩釋制劑,使GSP得到進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)、利用。