楊 聰，高建煒，馬江濤，海 娥，鄒 悅，陳麗莉，李小璐，韓 坤，張術(shù)斌

炭疽是由炭疽芽胞桿菌引起的一種人獸共患傳染病。主要傳染源為牛、羊、馬等食草動(dòng)物，人因接觸患病動(dòng)物而被感染[1]。寧夏是炭疽自然疫源地，自2014年以來(lái)疫情呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且疫源地面積較廣，防控難度逐漸增大[2]。有研究發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌的致病力與其毒力因子有關(guān)，當(dāng)菌體中具有毒力因子即可判定為強(qiáng)毒菌株[3]。由于炭疽芽胞桿菌遺傳進(jìn)化相對(duì)保守，導(dǎo)致其基因缺乏遺傳多樣性，目前常用的基因分型技術(shù)主要有可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)和單核苷酸多態(tài)性(canonical single nucleotide polymorphism, canSNP)兩種，對(duì)揭示菌株的遺傳進(jìn)化特征具有重要意義[4]。為了解寧夏炭疽芽胞桿菌的致病力和基因分型特征，揭示菌株間的遺傳特征及基因型別，本研究對(duì)2019-2020年寧夏各地區(qū)分離到的炭疽芽胞桿菌進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)研究，以期為疫情溯源提供線索和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 本研究所用菌株為2019-2020年本實(shí)驗(yàn)室收集保存的臨床分離菌株，共分離到4株炭疽芽胞桿菌，全部分離自患者皮膚滲出液(表1)。

表1 2019-2020年寧夏臨床分離炭疽芽胞桿菌菌株信息Tab.1 Background information on strains of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020

1.2 試驗(yàn)材料 Tag DNA聚合酶、無(wú)菌水、DNA Marker2000購(gòu)自全式金生物有限公司；核酸提取試劑盒(QIAGEN DNA Mini Kit)購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；血瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)自青島海博生物有限公司。MLVA-15各位點(diǎn)引物由上海生工生物公司合成；SNP探針及引物由中國(guó)疾控中心傳染病所提供；ABI7500Fast熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株基因組DNA的提取 按照QIAGEN試劑盒步驟提取。

1.3.2 毒力鑒定 采用文獻(xiàn)報(bào)道的4個(gè)毒力因子位點(diǎn)[5]設(shè)計(jì)引物(表2)。反應(yīng)體系為25 μL：含Tag DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板3 μL，無(wú)菌水7.5 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min， 30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表2 毒力因子引物序列信息Tab.2 Information on primer sequences for virulence genes

1.3.3 MLVA-15分型 將分離到的菌株提取核酸后，采用參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道的引物序列和PCR方法擴(kuò)增菌株的15個(gè)可變重復(fù)序列(VNTR)位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL：含Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無(wú)菌水6 μL。擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。其中vrrB1、vrrB2位點(diǎn)退火溫度為55 ℃，VNTR12、VNTR16、VNTR 17、VNTR 35位點(diǎn)退火溫度為52 ℃，其余反應(yīng)條件均相同。將擴(kuò)增為陽(yáng)性的樣品送往上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 canSNP分型 根據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道的炭疽芽胞桿菌的13個(gè)SNP位點(diǎn)，使用TaqMan探針?lè)▽?duì)菌株的核酸進(jìn)行檢測(cè)。建立20 μL擴(kuò)增體系，包含：Tag DNA聚合酶10 μL，上下游引物及探針各0.4 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌水7.4 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)；40 ℃ 30 s。使用熒光定量PCR儀7500FAST進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)所檢測(cè)到的熒光信號(hào)，對(duì)照探針序列，確定所檢測(cè)的SNP位點(diǎn)是哪一種核苷酸。

2 結(jié) 果

2.1 炭疽芽胞桿菌毒力鑒定情況 通過(guò)對(duì)分離到的4株炭疽芽胞桿菌基因組DNA經(jīng)普通PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在900 bp、923 bp、373 bp和1 242 bp處分別出現(xiàn)目標(biāo)條帶(圖1)，由此可判定這4株炭疽芽胞桿菌均為強(qiáng)毒菌株。

A：擴(kuò)增Lef基因；B：擴(kuò)增Pag基因；C：擴(kuò)增Cap基因；D：擴(kuò)增Cya基因注：M為2 kb DNA Marker；5、11、17、23為陰性對(duì)照；6、12、18、24為陽(yáng)性對(duì)照；其余膠孔為檢測(cè)樣本。圖1 2019-2020年炭疽芽胞桿菌毒力基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Detection on virulence genes of B. anthracis by PCR

2.2 MLVA-15分型 通過(guò)對(duì)分離到的4株炭疽芽胞桿菌基因組DNA進(jìn)行MLVA-15分型，結(jié)果顯示4株炭疽芽胞桿菌在15個(gè)VNTR多態(tài)性位點(diǎn)處的擴(kuò)增產(chǎn)物大小均相同(表3)，屬于同一個(gè)種群，結(jié)果提示該種群菌株可能是寧夏的主要流行菌群。

表3 2019-2020寧夏炭疽芽胞桿菌VNTR位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物Tab.3 Amplification results of the VNTR locus of B. anthracis in Ningxia from 2019 to 2020

2.3 canSNP分型 通過(guò)對(duì)分離到的4株炭疽芽胞桿菌基因組DNA進(jìn)行canSNP分型，并與文獻(xiàn)比對(duì)位點(diǎn)的變異情況(表4)，結(jié)果顯示4株炭疽芽胞桿菌均為A.Br.001/002型，是我國(guó)最常見(jiàn)的SNP基因型。

3 討 論

炭疽是一種嚴(yán)重的人獸共患自然疫源性傳染病，呈現(xiàn)世界范圍內(nèi)流行。不僅能使人和動(dòng)物發(fā)病甚至死亡，還是一種潛在的生物戰(zhàn)劑，可引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[7]。人感染炭疽，根據(jù)感染途徑不同，可分為肺炭疽、腸炭疽和皮膚炭疽，其中皮膚炭疽最為常見(jiàn)。寧夏是皮膚炭疽疫情高發(fā)省份之一，據(jù)記載自1958年起就有病例報(bào)告，2004-2018年平均報(bào)告發(fā)病率高于全國(guó)[2]；且寧夏地處西北內(nèi)陸高原，有天然的草場(chǎng)，牛羊養(yǎng)殖貿(mào)易發(fā)展迅速，周邊省份均有皮膚炭疽疫情，存在疫情輸入的風(fēng)險(xiǎn)，因此，寧夏皮膚炭疽疫情防控壓力和難度較大。雖然有針對(duì)寧夏皮膚炭疽流行特征及炭疽芽胞桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢出情況的報(bào)道[8-10]，但缺乏對(duì)引起皮膚炭疽疫情的病原菌的致病力強(qiáng)弱及基因分型方面的研究。

炭疽芽胞桿菌的基因組是由1個(gè)環(huán)狀染色體和2個(gè)質(zhì)粒(PXO1和PXO2)組成，主要致病因子位于這2個(gè)質(zhì)粒上。當(dāng)炭疽芽胞桿菌同時(shí)具有這兩種毒性質(zhì)粒時(shí)，菌體就會(huì)有很強(qiáng)的致病力，一旦失去其中一個(gè)因子，致病力會(huì)隨之下降[11]。本研究發(fā)現(xiàn)2019-2020年分離到的4株炭疽芽胞桿菌均為強(qiáng)致病力的菌株，且分離到菌株的患者臨床癥狀較為嚴(yán)重[12]。推測(cè)菌株致病力的強(qiáng)弱可能與患者臨床癥狀具有一定的相關(guān)性。

炭疽芽胞桿菌在外界環(huán)境中可形成芽胞從而導(dǎo)致菌株的遺傳學(xué)性狀較為穩(wěn)定，而細(xì)菌學(xué)常用到的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分子標(biāo)記技術(shù)及脈沖場(chǎng)凝膠(PFGE)電泳分子分型技術(shù)僅能鑒定到種屬間的差異[13]。目前常用于炭疽芽胞桿菌基因分型的方法主要有MLVA和canSNP兩種。其中MLVA分型方法證明可用于鑒別炭疽之間的差異及多樣性，通過(guò)區(qū)分基因組上不同串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)的重復(fù)數(shù)鑒別菌株，是較好的分子分型方法之一[14]。且有學(xué)者對(duì)我國(guó)北方省份106株臨床分離的炭疽芽胞桿菌進(jìn)行了MLVA-15分型，共分成36個(gè)基因型，極大的豐富了我國(guó)炭疽芽胞桿菌基因型別[15]。本研究運(yùn)用MLVA-15分型技術(shù)對(duì)2019-2020年寧夏分離到的炭疽芽胞桿菌桿菌進(jìn)行基因分型，雖然菌株來(lái)源于不同縣區(qū)不同年份，但結(jié)果表明4株分離菌株屬于同一個(gè)種群，提示菌株間存在流行病學(xué)關(guān)聯(lián)。canSNP是一種在地理分布上進(jìn)行溯源的基因分型方法[4]。據(jù)報(bào)道中國(guó)境內(nèi)的炭疽芽胞桿菌共分為5種canSNP型別，分別為A.Br.001/002、A.Br.008/009、A.Br.Vollum、A.Br.Aust.94和A.Br.Ames。本研究結(jié)果顯示2019-2020年分離到的4株的炭疽芽胞桿菌canSNP型別為A.Br.001/002型，此種型別在貴州、云南、陜西、內(nèi)蒙古等地方均有分布，是我國(guó)最為常見(jiàn)的SNP基因型[16-19]。

本研究對(duì)2019-2020年寧夏分離的炭疽芽胞桿菌菌株進(jìn)行了初步的毒力鑒定及基因分型研究，了解了寧夏炭疽芽胞桿菌致病力及分子遺傳特征。由于菌株分離率較低，用于實(shí)驗(yàn)研究的樣本和來(lái)源較為局限，應(yīng)當(dāng)對(duì)更多的菌株進(jìn)行基因分型研究，用于揭示寧夏炭疽芽胞桿菌的基因型別和分子流行病學(xué)特征，為本地炭疽疫情的預(yù)警和防控提供更全面的實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。雖然寧夏皮膚炭疽目前處于較低的散發(fā)水平，但由于疫源地消毒效果不明、農(nóng)民防控意識(shí)淡薄、牲畜交易控制難度較大等原因，寧夏皮膚炭疽疫情仍然存在擴(kuò)散傳播的風(fēng)險(xiǎn)。因此，今后應(yīng)提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力，提高炭疽芽胞桿菌的分離率并加強(qiáng)分子生物學(xué)檢測(cè)溯源工作，為更好的控制疫情提供有力保障。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：楊聰，高建煒，馬江濤，等. 2019-2020年寧夏炭疽芽胞桿菌毒力鑒定及基因分型研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：447-450，457. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.060