王曉英，羅 明，李俊剛，張匯征

由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染導致的結核病仍是全世界十大死因之一，并且是最致命的傳染性疾病之一。而耐藥結核病的出現，尤其是耐多藥結核病(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(extensive drug resistant tuberculosis，XDR-TB)的出現，使得結核病的防控和治療工作更加困難。據世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估算，2020年全球耐多藥結核病及利福平耐藥結核病(rifampicin resistant tuberculosis, RR-TB)患者數約為15.8萬。2019年，我國約有1.6萬名MDR/RR-TB患者，約占全球MDR/RR-TB病例的10%。然而，RR-/MDR-TB的治療非常困難，成功率僅為59%[1]。近年來，抗結核藥物的研發(fā)取得了一些進展。2019年，WHO在耐藥結核病治療整合版指南中，將德拉馬尼列為MDR-TB和XDR-TB治療的C組藥物[2]。PA-824(Pretomanid)是近半個世紀以來批準上市的第3個抗結核病新藥。其與貝達喹啉和利奈唑胺組成的BPaL方案針對XDR-TB或無法耐受治療/治療欠佳的MDR-TB成人患者有較好的治療效果。參加此治療方案的109名高度耐藥結核病患者在經過6個月治療后，治療成功率高達89.9%[3]。然而，德拉馬尼和PA-824作為抗結核新藥，也被報道存在MTB對這兩種藥物耐藥的情況。因此，及時檢測MTB對這兩種藥物的耐藥情況，能夠最大限度的降低耐藥風險并提高治療的有效性。本文對德拉馬尼和PA-824的耐藥機制及耐藥相關基因突變情況進行了綜述，以期為今后這兩種藥物耐藥株的快速檢測提供參考。

1 德拉馬尼和PA-824的作用機理

德拉馬尼和PA-824同屬硝基咪唑類抗結核藥物，均是一種前體藥物，其作用機理類似。

1.1 德拉馬尼的作用機理 德拉馬尼是一種硝基二氫咪唑類衍生物的新型抗結核藥物，于2014年被歐洲藥品管理局批準用于治療成人肺部MDR-TB。其作用機制是通過抑制MTB分枝菌酸的合成，尤其是甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸的合成，進而擾亂MTB細胞壁的合成，有助于藥物對MTB的滲透，從而達到殺菌的效果[4-5]。另外，也有研究表明，德拉馬尼對MTB的抑制作用可能與NO等活性自由基的釋放有關[6]。

1.2 PA-824的作用機理 PA-824具有較高的抗MTB活性，對復制期和非復制期的MTB均有較好的殺菌作用。其對MTB的殺菌機制體現在好氧殺菌和厭氧殺菌兩個方面。好氧殺菌機制主要通過將MTB細胞壁分枝菌酸酯上的羥基氧化為羰基，從而抑制MTB細胞壁分枝菌酸的合成而發(fā)揮作用[7-9]。因PA-824是一種前體藥物，其在發(fā)揮抗MTB作用之前首先會被MTB激活。激活后的PA-824的4′端硝基咪唑基團能夠形成活化的中間體，隨后損傷MTB細胞內的其他分子。而在其厭氧殺菌機制中，PA-824可直接作為NO供體，而NO可直接抑制MTB呼吸鏈的電子傳遞，從而抑制MTB的生長[10]。

2 德拉馬尼和PA-824的耐藥機制

德拉馬尼和PA-824同為硝基咪唑類抗結核藥物，其耐藥機制也基本相同(圖1)。有研究認為，MTB對這兩種藥物耐藥主要與激活前體藥物所需的酶功能的喪失有關。作為前體藥物，德拉馬尼和PA-824需要脫氮黃素(輔因子F420)依賴性硝基還原酶[deazaflavin (F420cofactor)-dependent nitroreductase, Ddn]激活其抗結核活性，而脫氮黃素由4種F420生物合成蛋白(F420biosynthesis protein, Fbi)共同參與合成，包括原來已報道的FbiA、FbiB、FbiC以及最新發(fā)現的FbiD[11-12]。而且F420的氧化還原循環(huán)需要葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(F420dependent glucose 6-phosphate dehydrogenase, Fgd1)的參與[13-15]。因此，ddn、fgd1以及參與F420生物合成途徑的fbiA、fbiB、fbiC和fbiD中任一基因突變都可能會引起MTB對德拉馬尼和PA-824的耐藥。雖然德拉馬尼和PA-824存在類似的耐藥機制，但目前鮮有關于這兩種藥物耐藥情況的比較分析。目前的研究表明，對德拉馬尼和PA-824耐藥的MTB存在部分相同的基因突變，但突變位點不盡相同。本文將對這兩種藥物耐藥相關基因及其突變位點進行詳細的分析，以期為這兩種藥物耐藥株的快速檢測及其在臨床上的合理應用提供參考。

注：*為目前的研究尚未證實fbiD基因突變與德拉馬尼耐藥相關。圖1 參與德拉馬尼和PA-824生物激活的基因Fig.1 The genes participate in the activation of delamamid and PA-824

2.1ddn(Rv3547)基因 全長456 bp，編碼F420依賴性的硝基還原酶，從而激活前體藥物PA-824和德拉馬尼。Ddn還原活化PA-824是以PA-824為底物、F420為輔酶直接還原PA-824，產生抑菌產物[7]。在MTB對德拉馬尼耐藥相關的研究中，Schena等的研究采用全基因測序技術對德拉馬尼耐藥菌株進行檢測，結果發(fā)現僅ddn突變(Trp-88→STOP)可在德拉馬尼耐藥菌株中檢測到，說明其與德拉馬尼耐藥相關[16]。Fujiwara等在臨床MDR-TB分離株中檢測到了德拉馬尼耐藥菌株中存在氨基酸改變?yōu)長107P以及nt59-101的刪除突變[13]。Zheng等研究表明在4株德拉馬尼耐藥MTB菌株中，有2株存在ddn基因第81位密碼子突變[17]。而在MTB對PA-824耐藥的相關研究中，Haver等的研究表明，在183例PA-824誘導耐藥的MTB菌株中，檢測出53株中ddn基因存在19種突變，主要突變類型為C32A，導致的氨基酸改變?yōu)镾er11→STOP(58%，31/53)[12]。此外，多項研究表明，在體外誘導的PA-824耐藥菌株中，發(fā)現了ddn基因突變，但突變位點不盡相同[4,18-19]。Lee等的研究表明，雖然德拉馬尼和PA-824耐藥菌株中均存在ddn基因突變，但德拉馬尼和PA-824附著在Ddn上的位點不同。該研究發(fā)現，ddn基因S78Y突變的MTB對PA-824表現出耐藥但對德拉馬尼卻仍舊敏感，而ddn基因L49P突變卻導致MTB對德拉馬尼和PA-824的交叉耐藥[20]。

2.2fgd1(Rv0407)基因 全長1 011 bp，編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，催化葡萄糖6-磷酸氧化為磷酸葡萄糖酸內酯，進而將F420還原為F420H2[21]。Bolemberg等在MTB臨床分離株中檢測出了fgd1基因突變，發(fā)現密碼子49的位置發(fā)生了移碼突變[22]。而Fujiwara等在MDR-TB臨床分離株中同樣檢測到了fgd1基因突變，發(fā)現在密碼子320的位置發(fā)生了置換突變[13]。而在體外誘導的PA-824耐藥菌株中，多項研究也檢測到了fgd1基因突變，但突變位置比較分散，發(fā)生在密碼子43和密碼子230之間，且每一種突變類型只能在1株突變菌株中檢測到，僅P43R突變在2株PA-824耐藥菌株中重復檢出[4,12, 18-19]。

2.3fbiA(Rv3261)基因 全長996 bp，fbiA編碼2-磷酸乳酸轉移酶，負責將2-二磷酸-5-鳥苷的磷酸乳酯部分轉移到FO(7,8-二甲基-8-羥基-5-去氮雜黃素)中，FO隨后參與F420的生物合成[23]。Bloemberg等及Hoffman等關于德拉馬尼耐藥機制的研究表明，在德拉馬尼耐藥的臨床MTB分離株以及XDR-TB中檢測到了第49位密碼子突變(分別為D49Y和D49T)[22, 24]，而Schena等則在德拉馬尼耐藥的XDR-TB臨床分離株中檢測到了第250位密碼子突變(K250*)[16]，提示第49位和第250位密碼子突變可能與德拉馬尼耐藥有關。Battaglia等通過對德拉馬尼耐藥的MTB菌株進行檢測，發(fā)現fbiA基因 K2E、V154I、I208V、I209V、K250*、S126P、R304Q突變與德拉馬尼最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的升高有關[25]。在關于MTB對PA-824耐藥機制的兩個研究中，Haver等檢測出了27個無義突變或者是移碼突變，突變位點分布在第21-323位密碼子之間，其中第56位(L56P，L56P[T167C])、第81位(Q81P[242C插入])、第119位(L119P，L119P[T356C])以及第192位(K192K[575A插入]，K192S[575A插入])密碼子突變分別在2株PA-824耐藥菌株中檢測到，而其他密碼子突變僅在1株PA-824耐藥菌株中檢測到[12]。而Kidwai等的研究也發(fā)現由于fbiA基因滅活導致MTB對PA-824耐藥，但本研究中并未列舉具體的突變位點[19]。

2.4fbiB(Rv3262)基因 全長1 347 bp，fbiB編碼L-谷氨酸連接酶，通過向F420-0中添加L-谷氨酸殘基來催化F420生物合成途徑的最后步驟，產生聚L-谷氨酸尾[26]。目前，關于MTB對德拉馬尼耐藥機制的研究中，Battaglia等通過對德拉馬尼耐藥的MTB菌株進行檢測，發(fā)現fbiB基因P361A突變與德拉馬尼MIC的升高有關[25]。然而，Nieto Ramirez等的研究表明，fbiB基因相關的突變僅在德拉馬尼敏感的MTB菌株中檢測到[27]。而關于MTB對PA-824耐藥機制的研究中，Haver等的研究表明，在體外誘導的PA-824耐藥菌株中，第39位(Y39*[G117A])、第153位(G153V[G458T])以及第361位(P361A[C1081G])密碼子發(fā)生了基因突變且分別僅在1株耐藥菌株中檢測到[12]。雖然，Kidwai等的研究也發(fā)現了由于fbiB基因滅活導致的MTB對PA-824耐藥，但研究中并未列舉具體的突變位點[19]。因此，fbiB基因相關突變是否與德拉馬尼耐藥相關，還需要進行更深入的研究。

2.5fbiC(Rv1173)基因 全長2 571 bp，fbiC基因編碼FO合酶，將羥基芐基從4-羥基苯丙酮酸轉移到嘧啶二酮，隨后參與嘧啶二酮和FO之間F420生物合成途徑的一部分，FbiC對F420的合成至關重要[6]。fbiC基因的失活使MTB對氧化應激反應變得敏感。Pang等對德拉馬尼耐藥的XDR-MTB菌株進行檢測，并在2株XDR-MTB菌株中檢測到了fbiC第318位密碼子突變(V318I)，而且這2株XDR-MTB菌株中并未檢測到fbiA、fbiB、fgd1以及ddn基因突變[28]。Zheng等也在1株德拉馬尼耐藥MTB菌株中檢測到了fbiC第318位密碼子突變(V318I)[17]。Battaglia等通過對德拉馬尼耐藥的MTB菌株進行檢測，發(fā)現fbiC基因C105R、L228F、L377P、A856P、A835V、S762N突變與德拉馬尼MIC的升高有關[25]。這些研究表明，fbiC基因突變可能與德拉馬尼耐藥相關。在關于MTB對PA-824耐藥機制的研究中，Haver等在6株體外誘導的PA-824耐藥菌株中，檢測到了第720位密碼子突變(V720I和V720G)，并在4株體外誘導的PA-824耐藥菌株中檢測到了第843位密碼子突變[12]。Manjunatha等的研究檢測到了體外誘導的PA-824耐藥MTB菌株中存在fbiC基因突變，突變位點為第630位密碼子(V630E)[4]。其他兩項研究也在體外誘導的PA-824耐藥MTB菌株中檢測到了fbiC基因刪除突變，從而導致MTB對PA-824耐藥[18-19]。

2.6fbiD(Rv2983)基因 FbiD為磷酸烯醇丙酮酸尿苷轉移酶，用來合成部分磷酸烯醇丙酮酸并隨后被FbiA轉移到FO中，而FO為F420的前體。而且，F420的生物合成也被證實需要FbiD的參與[11]。Rifat等的研究表明，fbiD基因突變將會導致MTB對德拉馬尼和PA-824耐藥。該研究通過對來自于47只小鼠的161株PA-824耐藥菌株進行全基因組測序發(fā)現了99個突變，其中91%的突變出現在已報道的5種基因上：fbiC(56%)、fbiA(15%)、ddn(12%)、fgd(4%)以及fbiB(4%)，而剩余9%的PA-824耐藥菌株存在fbiD基因突變，包括8種點突變導致的氨基酸改變(R25S, R25G, A68E, A132V, G147C, C152R, Q114R, A198P)和A27之后插入C以及I129 (-ATC)的刪除突變[11]。fbiD基因突變導致了MTB對德拉馬尼和PA-824耐藥，但值得注意的是，fbiD和fbiB突變的菌株顯示出對PA-824的高水平耐藥，但對德拉馬尼的敏感性卻只有相對很小的改變[11]，這也可能解釋了在以往德拉馬尼耐藥的MTB菌株中未檢測到fbiD和fbiB基因突變的原因。

3 展 望

德拉馬尼和PA-824同屬硝基咪唑類抗結核藥物，對MDR-TB以及XDR-TB有較好的治療前景，但目前研究表明，德拉馬尼和PA-824的耐藥相關基因突變卻存在差異。目前報道的與MTB對德拉馬尼耐藥相關的基因包括ddn、fgd1、fbiA、fbiB以及fbiC；而與MTB對PA-824耐藥相關的基因包括ddn、fgd1、fbiA、fbiB、fbiC以及fbiD，且突變位點比較分散。fbiD基因突變與PA-824的高水平耐藥相關，但卻并未表現出對德拉馬尼的耐藥。而fbiB基因突變是否與德拉馬尼耐藥相關還需要進一步的研究。雖然德拉馬尼和PA-824耐藥相關基因存在重疊，但突變位點卻不盡相同。另外，對德拉馬尼耐藥MTB菌株的相關研究中均為臨床分離菌株，而PA-824由于臨床應用較少，其耐藥相關菌株多是體外誘導。因此，在對德拉馬尼和PA-824的耐藥快速檢測的相關研究中，應注意耐藥相關基因突變位點分布的差異性。綜上所述，本文對德拉馬尼和PA-824耐藥相關基因的突變情況進行了詳細的分析，為進一步研究德拉馬尼和PA-824耐藥相關機制以及開發(fā)新的耐藥快速檢測方法提供了理論參考。

利益沖突：無

引用本文格式：王曉英，羅明，李俊剛，等. 結核分枝桿菌德拉馬尼和PA-824耐藥相關機制研究進展[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：423-427. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.062