白 鷺，寧喚喚，康 健，梁 璇，謝燕玲，彭鈺君，張婧瑤，路延之，柏銀蘭

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)經(jīng)呼吸道感染引起的危害嚴重的慢性傳染病。據(jù)WHO最新報道，2020年全球新發(fā)TB病例為1 000萬，引起約140萬人死亡[1]。卡介苗(BacillusCalmette-Guerin，BCG)是牛分枝桿菌連續(xù)傳代后獲得的減毒活疫苗，是惟一獲得批準的TB預(yù)防性疫苗。但是接種BCG對成人TB的保護作用不完善[2]。此外，BCG是減毒活疫苗，在免疫低下人群接種可能造成播散性感染。因此，研發(fā)安全、有效的疫苗是TB防治領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

BCG在基因傳代中發(fā)生一些基因丟失，丟失的基因片段稱為差異區(qū)域(Region of difference，RD)[3]。RD區(qū)編碼的免疫優(yōu)勢抗原丟失被認為是BCG保護作用不完善的主要原因之一[4]。如RD1區(qū)Rv3875編碼的6 kDa早期分泌靶抗原(6 kDa early secretory antigen target，ESAT-6)具有多個T、B細胞以及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抗原表位，可誘導(dǎo)特異性體液免疫，刺激T細胞產(chǎn)生IFN-γ[5]。ESAT-6是WXG100蛋白家族中第一個發(fā)現(xiàn)的蛋白[6]，WXG100蛋白家族一般由約100個氨基酸組成，區(qū)域中心含有保守的Trp-X-Gly(WXG)基序，共有23個成員(EsxA-EsxW)。WXG100家族蛋白的編碼基因大多位于ESAT-6分泌系統(tǒng)(ESAT-6 secretion system，ESX)的基因座上，是Mtb特有的VII型分泌系統(tǒng)(type VII secretion system，T7SS)典型的分泌底物。WXG100蛋白家族不僅參與Mtb致病機制，而且大多數(shù)是可誘導(dǎo)T細胞免疫應(yīng)答的抗原[7]。

Rv3619c基因編碼的WXG100蛋白家族EsxV是一種分泌蛋白，位于RD9區(qū)[8]，也是Mtb和BCG之間的差異蛋白。研究表明，EsxV重組蛋白經(jīng)肌肉免疫兔，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體[9]。EsxV經(jīng)皮下接種可誘導(dǎo)小鼠Th1型細胞免疫應(yīng)答[8]。由脂質(zhì)體包裹EsxV制備的納米疫苗經(jīng)皮下接種小鼠，可刺激產(chǎn)生Th1型細胞免疫應(yīng)答，且能夠誘導(dǎo)長效的免疫記憶，接種后可降低Mtb感染小鼠臟器的荷菌數(shù)[10]。EsxV皮下免疫豚鼠，Mtb感染后可引發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)，表明其可用于診斷試劑的研制[11]。因此，EsxV免疫可誘導(dǎo)宿主抗Mtb感染的免疫力，可用于TB新疫苗的研制。

Mtb主要經(jīng)呼吸道傳播，所以黏膜免疫在抵抗Mtb感染中發(fā)揮重要作用[12]。細菌第二信號分子環(huán)二腺苷酸(Cyclic dimeric adenosine monophosphate，c-di-AMP)能夠激活I(lǐng)型IFN[13]、自噬、炎癥小體[14-15]等多種固有免疫調(diào)控機制。同時，c-di-AMP可作為黏膜佐劑，增強抗原誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答[16]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP作為黏膜佐劑，可顯著提高ESAT-6誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平[17]。表明c-di-AMP可作為黏膜佐劑用于亞單位疫苗的研制。本研究在原核表達系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達并純化EsxV重組蛋白，以EsxV和/或以c-di-AMP為佐劑構(gòu)建亞單位疫苗，對EsxV為基礎(chǔ)的亞單位疫苗黏膜免疫小鼠誘導(dǎo)的體液和細胞免疫應(yīng)答進行了研究。本研究將為EsxV用于TB疫苗的研制提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 分子生物學(xué)試劑：DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司，PCR回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。Ni Sepharose購自GE公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；PVDF膜購自Millipore公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactoside，IPTG)購自Sigma公司；Total RNA Kit I試劑盒購自O(shè)MEGA公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒購自Vazyme公司。

免疫學(xué)試劑：6×His單克隆抗體購自Abcam公司；Mtb H37Rv小鼠感染血清為本室制備保存；HRP標記的山羊抗小鼠IgG、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b和IgG 3購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液購自Selleck公司；c-di-AMP購自InvivoGen公司；細胞增殖MTS檢測試劑盒購自Promega公司；小鼠細胞因子檢測試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 菌株與實驗動物 大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α、BL21菌株為本室保存。6～8周齡雌性無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)BALB/c小鼠，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。實驗動物使用3R原則給予人道關(guān)懷。實驗操作根據(jù)《實驗動物飼養(yǎng)管理與使用指南》的建議進行。

1.3 方 法

1.3.1 引物設(shè)計及目的基因獲取 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲取Mtb H37Rv株的esxV編碼序列，設(shè)計一步克隆法引物序列，由擎科生物科技有限公司合成引物(表 1)。以Mtb H37Rv株DNA為模板，PCR擴增目的基因esxV。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，回收目的基因片段。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.3.2 原核表達載體的構(gòu)建 pET 28a(+)質(zhì)粒以NdeI/Hind III酶切，37 ℃反應(yīng)3 h。1%核酸電泳后回收線性化載體。線性化pET 28a(+)和純化的PCR產(chǎn)物進行重組反應(yīng)，37 ℃ 30 min。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用含25 μg/mL卡那霉素(Kan)的抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑取陽性克隆接種于液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒。NdeI/Hind III酶切鑒定陽性質(zhì)粒進一步序列測定(擎科生物)。

1.3.3 EsxV的誘導(dǎo)表達及鑒定 將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21菌株，挑取陽性克隆于含25 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，按照1∶1 000的比例將細菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5 mL新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。制備誘導(dǎo)菌蛋白樣品，15% SDS-PAGE電泳觀察目的蛋白的表達情況。

菌體蛋白樣品SDS-PAGE電泳后，100 V電壓轉(zhuǎn)印PVDF膜；PBST洗膜后，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入6×His單克隆抗體(1∶500)和Mtb H37Rv小鼠感染血清(1∶500)4 ℃孵育過夜；PBST洗膜后，加入HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)37 ℃孵育45 min；PBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，觀察蛋白表達。

1.3.4 EsxV的大量純化 重組菌大量誘導(dǎo)表達，采用Ni-NTA agarose親和層析法純化目的蛋白。用50 mL的Lysis buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，0.5% Trtion-X 100，0.5 mg/mL Lysozyme，1 mmol/L PMSF，pH8.0)重懸菌體沉淀，室溫搖床孵育1 h，冰浴下超聲10 min，5 s ON，10 s OFF。12 000 r/min 4 ℃離心30 min，將上清移入Binding buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH8.0)平衡后的純化Ni-NTA agarose柱中，4 ℃旋轉(zhuǎn)儀上結(jié)合2 h，分別以50 mL Binding buffer和Wash buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L imidazole，pH8.0)洗滌。Elution buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH8.0)分段洗脫，分別流出液于1.5 mL EP管。收集包含目的蛋白的洗脫液以尿素梯度PBS透析，最后在10%甘油+PBS緩沖液透析30 min，分裝后-80 ℃保存。

在本實驗教學(xué)中，教師先創(chuàng)設(shè)情境，展示過氧化氫溶液，提出問題：“在哪些條件下可以加快過氧化氫分解？”以問題引導(dǎo)學(xué)生回憶其分解過程，調(diào)動已有知識基礎(chǔ)，思考、分析并得出結(jié)論：過氧化氫在加熱、加入催化劑FeCl3溶液和過氧化酶時均能加快分解，且不同條件下分解速率不同。由此明確實驗課題——比較過氧化氫在不同條件下的分解速率。

1.3.5 動物免疫 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠20只，隨機分成4組，即正常對照組(Na?ve)、佐劑組(c-di-AMP)、蛋白組(EsxV)、聯(lián)合免疫組(EsxV:c-di-AMP)。各組小鼠分別滴鼻給予50 μL/只的PBS、c-di-AMP 5 μg、EsxV 30 μg、EsxV 30 μg+c-di-AMP 5 μg，間隔2周，免疫4次。第3和第4次免疫EsxV蛋白劑量減半，佐劑劑量不變。

1.3.6 小鼠血清抗體及亞類檢測 免疫完成6周后，取小鼠眼靜脈血，分離血清。用10 μg/mL的EsxV抗原包被96孔ELISA酶標板，分別加入經(jīng)倍比稀釋的小鼠血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，分別加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG、IgA、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b、IgG 3、IgM二抗(1∶5 000)100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；TMB顯色，酶標儀檢測OD450值。

1.3.7 小鼠脾細胞增殖檢測 處死小鼠，無菌取脾臟，制備脾細胞懸液，調(diào)整濃度至1×107個/mL，接種96孔板100 μL/孔；刺激組加入去除內(nèi)毒素的EsxV蛋白或者ConA終濃度分別為5 μg/mL和2.5 μg/mL，陰性對照孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，并設(shè)置空白對照孔。置細胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)68 h后，加入MTS 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測OD490值，計算脾細胞刺激指數(shù)(Stimulated Index，SI)=OD490(刺激組OD490-空白對照OD490)/(陰性對照OD490-空白對照OD490)。

1.3.8 組織RNA的提取及實時定量PCR 取小鼠肺臟和脾臟部分組織，Total RNA Kit I試劑盒提取組織RNA。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑進行逆轉(zhuǎn)錄，實時定量PCR檢測IFN-γ、IL-2、IL-10轉(zhuǎn)錄水平，以GAPDH作為內(nèi)參。檢測基因引物序列見表1。

1.3.9 脾細胞分泌細胞因子檢測 取1.3.7中的脾細胞懸液，接種96孔板為1×106個/100 μL/孔，刺激組加入去除內(nèi)毒素的EsxV蛋白至終濃度5 μg/mL，陰性對照孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，并設(shè)置空白對照孔。培養(yǎng)72 h，收集細胞培養(yǎng)上清。按照ELISA試劑盒說明書，檢測小鼠脾細胞上清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17的含量。

2 結(jié) 果

2.1 載體構(gòu)建esxV基因大小為285 bp，PCR擴增出與目的片段大小一致的特異條帶(圖1A)。將目的基因亞克隆入pET28a(+)載體，重組質(zhì)粒NdeI/Hind III酶切鑒定結(jié)果顯示，可切出esxV片段大小一致條帶(圖1B)。測序結(jié)果表明，插入序列與Mtb H37Rv株esxV公布序列完全一致。表明pET28a(+)-esxV原核表達載體建成功。

A：esxV的PCR擴增； B：重組載體酶切鑒定； M：marker；1：pET28a(+)-esxV圖1 原核表達載體構(gòu)建Fig.1 Construction of the prokaryotic expression vector

A: EsxV蛋白誘導(dǎo)表達；B: Western Blot鑒定EsxV蛋白(一抗為6xHis單克隆抗體)；C: Western Blot鑒定EsxV蛋白(一抗為H37Rv感染小鼠血清)；D: EsxV蛋白親和層析純化圖2 EsxV蛋白的表達與純化Fig.2 Expression and purification of EsxV

2.3 小鼠血清抗體檢測 ELISA檢測血清中特異性抗體水平，結(jié)果顯示EsxV免疫小鼠血清中抗原特異性IgG的滴度為1.6×103(稀釋度為1∶1 600)，EsxV:c-di-AMP免疫組特異性IgG滴度為3.2×103(稀釋度為1∶3 200)(圖3A)。表明EsxV抗原經(jīng)黏膜免疫可誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生，c-di-AMP作為佐劑可一定程度上提高抗原免疫誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。小鼠血清抗體以IgG為主(圖3B)，同時抗體亞類檢測結(jié)果表明，在1∶200稀釋度下，EsxV誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體以IgG 1為主(圖3C)，EsxV一定程度上抑制IgM水平。

A：抗體效價檢測；B：抗體亞類檢測(小鼠血清1∶200稀釋)；C：IgG亞類檢測(小鼠血清1∶200稀釋)；與對照組比較，①為P<0.05,②為P<0.01,③為P<0.001；④為P<0.05，⑤為P<0.01圖3 體液免疫應(yīng)答水平和抗體亞類檢測Fig.3 Humoral immune response level and antibody subclass detection

2.4 小鼠脾細胞增殖檢測 免疫小鼠脾細胞以ConA、EsxV體外刺激后，MTS法檢測細胞增殖情況，結(jié)果表明，非特異性抗原ConA可刺激所有組免疫小鼠脾細胞增殖，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A)。與對照組比較，EsxV免疫小鼠后脾細胞增殖呈增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.243,P>0.05)；EsxV:c-di-AMP免疫小鼠脾細胞增殖顯著(t=6.743，P<0.001)(圖4B)。表明c-di-AMP可增強EsxV經(jīng)黏膜免疫誘導(dǎo)抗原特異性的脾細胞增殖能力。

A：ConA蛋白刺激脾細胞；B：EsxV蛋白刺激脾細胞；與對照組比較，①為P<0.001圖4 免疫小鼠脾細胞增殖Fig.4 Splenocyte proliferation in immunized mice

2.5 免疫小鼠脾和肺細胞因子轉(zhuǎn)錄水平檢測 qRT-PCR檢測細胞因子轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果顯示，在脾臟，與對照組比較，EsxV免疫組IL-10轉(zhuǎn)錄水平下降(t=6.422,P<0.01)。EsxV:c-di-AMP免疫組IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平較對照組升高(t=6.359,P<0.01)(圖5A)；在肺部，與對照組比較，EsxV免疫組IFN-γ(t=2.605，P>0.05)、IL-2(t=2.504,P>0.05)轉(zhuǎn)錄水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義；IL-10轉(zhuǎn)錄水平下降(t=3.292，P<0.05)。EsxV:c-di-AMP免疫組IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平較對照組升高(t=7.829，P<0.01)，且高于EsxV免疫組(t=5.627，P<0.05)；IL-2和IL-10轉(zhuǎn)錄水平與對照組和EsxV免疫組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5B)。上述結(jié)果表明，EsxV免疫誘導(dǎo)脾和肺細胞因子表達水平不高，而c-di-AMP可增強EsxV經(jīng)黏膜免疫誘導(dǎo)的IFN-γ表達，但對EsxV誘導(dǎo)的IL-2和IL-10水平影響不大。

A：小鼠脾組織IFN-γ、IL-2和IL-10轉(zhuǎn)錄水平檢測；B：小鼠肺組織IFN-γ、IL-2和IL-10轉(zhuǎn)錄水平檢測；與對照組比較，①為P<0.05，②為P<0.01；③為P<0.05圖5 小鼠脾和肺細胞因子轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 Cytokine transcription levels in mouse lung and spleen

2.6 脾細胞分泌細胞因子檢測 脾細胞體外抗原刺激后，ELISA法檢測細胞因子的分泌水平。結(jié)果顯示，EsxV免疫組各細胞因子的分泌水平與對照組相當。相比于EsxV免疫組，EsxV:c-di-AMP免疫組脾細胞的IFN-γ(t=8.818,P<0.001)、IL-2(t=8.061,P<0.001)、IL-10(t=6.588,P<0.001)和IL-17(t=2.632,P<0.05)分泌水平都增加(圖 6A-D)。結(jié)果表明，EsxV經(jīng)鼻免疫誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的能力不強，而c-di-AMP能夠增強EsxV誘導(dǎo)的脾Th1(IFN-γ、IL-2)、Th2(IL-10)和Th17(IL-17)型細胞免疫應(yīng)答。炎癥因子分泌水平檢測結(jié)果顯示，各組間的TNF-α(F=0.667,P>0.05)、IL-6(F=1.270,P>0.05)分泌水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖 6E-F)。

注：特異蛋白EsxV刺激小鼠脾細胞后IFN-γ(A)、IL-2(B)、IL-10(C)、IL-17(D)、TNF-α(E)、IL-6(F)的分泌水平。與對照組比較，①為P<0.001；②為P<0.05，③為P<0.001。圖6 小鼠脾細胞的細胞因子分泌水平Fig.6 Cytokine secretion by splenic lymphocytes in immunized mice

3 討 論

亞單位疫苗具有成份明確、安全性良好和誘導(dǎo)高水平的免疫應(yīng)答等優(yōu)點，是疫苗的重要種類之一。亞單位疫苗可將多個抗原有機組合起來，在適宜的佐劑輔助下誘導(dǎo)高水平抗Mtb感染的免疫應(yīng)答，且安全性好。增加抗原譜可有效提高亞單位疫苗的保護效率，篩選新的特異性Mtb抗原也是目前TB疫苗研制的重要方向之一。

WXG100蛋白大多具有免疫原性。ESAT-6是目前WXG100蛋白家族中研究最深入的蛋白，多項研究已證實其作為TB疫苗候選抗原的潛能[5]。EsxW、Rv2608以及Mtb潛伏感染蛋白Rv1813的融合蛋白組成的ID83亞單位疫苗與Toll樣受體激動劑聯(lián)合免疫小鼠，可誘導(dǎo)Th1型細胞免疫應(yīng)答，并對低劑量Mtb呼吸道感染具有保護力[18]。表達EsxH(Rv0288)與Ag85B的重組BCG免疫小鼠，可誘導(dǎo)Th1 CD4+細胞的增殖并且產(chǎn)生顯著的抗Mtb感染保護力[19]。EsxV經(jīng)肌肉免疫兔，可誘導(dǎo)特異性的抗體產(chǎn)生[9]。此外，有研究報道，EsxV經(jīng)黏膜接種能夠預(yù)防小鼠哮喘[20]。本研究成功構(gòu)建并原核表達WXG100家族蛋白Esx，重組EsxV蛋白經(jīng)鼻黏膜免疫小鼠，血清IgG效價可達到1∶1 600，以IgG 1亞類為主(圖3)。表明重組EsxV蛋白經(jīng)黏膜免疫，可誘導(dǎo)特異性的體液免疫應(yīng)答。EsxV蛋白經(jīng)鼻免疫小鼠，對脾和肺組織的Th1(IFN-γ、IL-2)型細胞因子的轉(zhuǎn)錄影響不大，但能抑制脾細胞Th2(IL-10)型細胞因子轉(zhuǎn)錄(圖5)。EsxV蛋白體外刺激免疫小鼠脾細胞，脾細胞增殖并不顯著，而且脾細胞分泌細胞因子水平也無變化。表明EsxV蛋白經(jīng)鼻黏膜免疫誘導(dǎo)的細胞免疫應(yīng)答水平并不高。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ESAT-6單獨免疫誘導(dǎo)的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答水平均不高，需要加入佐劑提高ESAT-6 的免疫原性[21]。因此，采用合適的佐劑可提高EsxV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平。

目前，用于臨床的疫苗佐劑有鋁佐劑，主要介導(dǎo)體液免疫，對細胞免疫的誘導(dǎo)效果不佳[22]。研究表明，加強小鼠黏膜免疫水平可提高抗Mtb感染能力[23]。c-di-AMP作為細菌的信號分子，可作為黏膜佐劑，與半乳糖苷聯(lián)合經(jīng)鼻黏膜接種，能夠誘導(dǎo)小鼠黏膜免疫及Th1/Th2/Th17型細胞免疫應(yīng)答[16]。c-di-AMP可增強流感抗原誘導(dǎo)的Th1/Th2/Th17和炎癥因子應(yīng)答[24]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP作為內(nèi)源性佐劑能夠增強重組BCG誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平[25]。c-di-AMP作為黏膜佐劑與ESAT-6聯(lián)合免疫時，可誘導(dǎo)較高水平的固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，并且具有抗Mtb的保護作用[17]。因此，c-di-AMP可增強Mtb抗原的免疫原性，并可用于黏膜免疫，可用于TB黏膜疫苗佐劑。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ESAT-6:c-di-AMP免疫組的抗體效價為1∶1 600，高于ESAT-6單獨免疫組的1∶800，同時發(fā)現(xiàn)較ESAT-6免疫組，ESAT-6：c-di-AMP免疫小鼠后可顯著提高肺泡灌洗液中的sIgA水平[17]。本研究中，EsxV:c-di-AMP免疫組特異性IgG抗體效價為1∶3 200，高于EsxV單獨免疫組的1∶1 600。本研究雖未檢測sIgA的水平，但血清IgG水平檢測獲得了與前期結(jié)果相似的結(jié)論[17]。

在小鼠臟器脾和肺中，c-di-AMP免疫后可誘導(dǎo)IFN-γ、IL-2以及IL-10的轉(zhuǎn)錄水平增加，表明c-di-AMP可增強機體Th1/Th2的免疫反應(yīng)。EsxV單獨免疫誘導(dǎo)的脾和肺Th1/Th2細胞因子轉(zhuǎn)錄水平不高，而EsxV:c-di-AMP經(jīng)鼻黏膜接種后誘導(dǎo)的細胞因子轉(zhuǎn)錄水平均低于c-di-AMP免疫組(圖5)。研究表明，c-di-AMP能夠激活干擾素基因刺激分子(stimulator of interferon genes，STING)介導(dǎo)的I型干擾素應(yīng)答，同時c-di-AMP的持續(xù)刺激能夠引發(fā)鈣蛋白酶對STING的降解[26]。因此，推測c-di-AMP在胞漿內(nèi)自限性、不連續(xù)的免疫調(diào)控機制，限制了其與EsxV抗原聯(lián)合免疫誘導(dǎo)的細胞因子表達水平，這與前期研究ESAT-6:c-di-AMP免疫后小鼠肺組織細胞因子轉(zhuǎn)錄水平比c-di-AMP單獨免疫組有所降低的結(jié)果相似[17]。EsxV:c-di-AMP誘導(dǎo)小鼠脾細胞顯著的Th1/Th2/Th17型細胞免疫應(yīng)答，但并不能增強炎癥因子(TNF-α、IL-6)的轉(zhuǎn)錄水平(圖6)，且IL-1β分泌水平均低于檢測下限。表明c-di-AMP不僅可增強EsxV誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而且不引起可能的炎癥病理損傷，因此，c-di-AMP作為黏膜免疫佐劑也具有安全性。

綜上，本研究獲得的EsxV:c-di-AMP亞單位疫苗組合免疫小鼠，可誘導(dǎo)體液和細胞免疫應(yīng)答，可用作TB亞單位新疫苗的研制。本課題組將進一步建立呼吸道感染動物模型，評價EsxV:c-di-AMP亞單位疫苗誘導(dǎo)的黏膜免疫應(yīng)答，并評價該疫苗對Mtb感染的免疫保護效率。

利益沖突：無

引用本文格式：白鷺，寧喚喚，康健，等. 結(jié)核分枝桿菌EsxV亞單位疫苗黏膜免疫誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答[J].中國人獸共患病學(xué)報，2022，38(5)：379-386. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.051