黃銀燕，吳亦斐，賈慶軍，程慶林，方子健，謝 立

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是全球十大死亡原因之一，主要是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起，以潛伏期長(zhǎng)，致死率高為主要特征。2020年全球約有987萬人感染結(jié)核病，發(fā)病率為127/10萬,較往年有所減緩。2015-2020年結(jié)核病發(fā)病率累計(jì)下降了11%，但未達(dá)到WHO提出的2020年終止結(jié)核病策略的要求。各國(guó)結(jié)核病流行的嚴(yán)重程度差異較大，30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家占全球所有估算發(fā)病率的86%，其中最嚴(yán)重的8個(gè)國(guó)家：印度(26%)、中國(guó)(8.5%)、印度尼西亞(8.4%)、菲律賓(6.0%)、巴基斯坦(5.8%)、尼日利亞(4.6%)、孟加拉國(guó)(3.6%)和南非(3.3%)，占總數(shù)的2/3。2020年所有新發(fā)病例中，成年男性患者占56%，成年女性占33%，兒童占11%。2020年全球新發(fā)耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistance tuberculosis，MDR-TB)和利福平耐藥結(jié)核病(Rifampicin resistance tuberculosis，RR-TB)患者有132 222例，廣泛耐藥(extensively drug-resistant，XDR)患者有25 681例[1]。

我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家，根據(jù)世界衛(wèi)生組織2021年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)， 2020年估算的結(jié)核病新發(fā)患者數(shù)為84.2萬(2019年為83.3萬)，估算發(fā)病率為59/10萬(2019年為58/10萬)，占全球總結(jié)核病患者的8.5%,僅次于印度[1]，較2019年略有上升。結(jié)核病的防控形勢(shì)依舊嚴(yán)峻，耐藥結(jié)核病防控形勢(shì)也不容樂觀，2019年全球新發(fā)耐藥結(jié)核病患者中我國(guó)占14%，僅次于印度[2]。

研究顯示，杭州市的結(jié)核病患者耐藥率2011年是31.3%[3]，2015年是22.3%[3]，2017年是20.1%[4]，耐多藥率2011年是11.6%[3]，2015年是8.0%[3]，2017年是3.74%[4]，均呈下降趨勢(shì)。本研究對(duì)2018年1月至2019年12月分離自杭州市周邊7個(gè)縣區(qū)的1 975份診斷為肺結(jié)核病人的培養(yǎng)菌株進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)和菌種鑒定，分析這些地區(qū)耐藥結(jié)核病的流行狀況，優(yōu)勢(shì)耐藥譜，不同地區(qū)間耐藥率的比較，初治和復(fù)治病人耐藥狀況，以及結(jié)合前幾年的研究數(shù)據(jù)，比較初治和復(fù)治病人耐藥率的變化趨勢(shì)，為提供更有效的耐藥結(jié)核病防控策略提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 菌株來自2018年1月至2019年12月杭州市余杭區(qū)、蕭山區(qū)、富陽區(qū)、臨安區(qū)、建德市、桐廬縣、淳安縣結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院肺結(jié)核病人的痰培養(yǎng)陽性標(biāo)本。痰培養(yǎng)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]分離分枝桿菌，酸性羅氏培養(yǎng)基購(gòu)自杭州市創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司。

1.2 分枝桿菌菌種鑒定 菌種鑒定采用硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn),具體操作參照文獻(xiàn)[5-6]。在噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而硝基苯甲酸培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，則為人型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriatuberculosis)，在兩種培養(yǎng)基上都不生長(zhǎng)，則為牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriabovis)，均屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)。在兩種培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)，則為非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculous mycobacteria，NTM)，硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3 分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 分枝桿菌藥物敏感實(shí)驗(yàn)按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]采用比例法進(jìn)行操作。液體培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)種至羅氏培養(yǎng)基，待生長(zhǎng)后采用比例法。藥物包括異煙肼(Isoniazid, INH)、利福平(Rifampicin, RFP)、鏈霉素(Streptomycin, SM)、乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)、氧氟沙星(Ofloxacin, OFX)、卡那霉素(Kanamycin, KM)，培養(yǎng)基藥物終濃度依次為0.2 μg/mL、40 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、2 μg/mL、30 μg/mL。具體操作參照文獻(xiàn)[5-6]，INH、SM、RFP、EMB購(gòu)自杭州市創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司，OFX、KM購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.4 相關(guān)定義 一線抗結(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、利福噴丁、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、鏈霉素。二線抗結(jié)核藥物包括卡那霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、乙硫(丙硫)異煙胺、對(duì)氨基水楊酸、阿米卡星、卷曲霉素、利奈唑胺、貝達(dá)喹啉、德拉馬尼、氯法齊明。本研究中使用的一線藥物為異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇，二線藥物為氧氟沙星、卡那霉素。

耐藥類型分為：①單耐藥，指僅對(duì)1種一線抗結(jié)核藥物耐藥；②一線藥物耐藥,指對(duì)1種或1種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥；③多耐藥， 指對(duì) 1 種以上一線抗結(jié)核藥物耐藥，但不包括同時(shí)對(duì) INH 和 RFP耐藥；④耐多藥結(jié)核病， 指至少同時(shí)對(duì)INH和RFP耐藥；⑤廣泛耐藥結(jié)核病，指在耐多藥的基礎(chǔ)上至少同時(shí)對(duì) 1 種氟喹諾酮類和 1 種二線注射類抗結(jié)核藥物耐藥；⑥RFP 耐藥結(jié)核病， 指對(duì) RFP 耐藥， 包括對(duì) RFP 耐藥的上述所有耐藥結(jié)核病類型(單耐藥、 多耐藥、 耐多藥、 廣泛耐藥結(jié)核病)[7]。

初治肺結(jié)核患者指有下列情況之一者：①?gòu)奈匆蚪Y(jié)核病使用過抗結(jié)核藥物治療的患者；②正進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化療方案規(guī)律用藥而未滿療程的患者(登記分類以治療開始時(shí)為準(zhǔn))；③不規(guī)則化療未滿1個(gè)月的患者。復(fù)治肺結(jié)核患者指有下列情況之一者：①因結(jié)核病不合理或不規(guī)律服用抗結(jié)核藥物治療≥1個(gè)月的患者；②初治失敗和復(fù)發(fā)患者[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用EXCEL軟件整理數(shù)據(jù)，用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組耐藥率比較用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果 1 975份培養(yǎng)菌株中，鑒定為結(jié)核分枝桿菌占87.6%(1 731/1 975)，鑒定為非結(jié)核分枝桿菌占12.4%(244/1 975)。

2.2 結(jié)核分枝桿菌的耐藥率 1 731株結(jié)核分枝桿菌中，對(duì)受試藥物全敏感的菌株占81.74%(1 415/1 731)株，18.26%(316/1 731)菌株至少對(duì)一種受試藥物耐藥，其中初治患者總耐藥率為17.74%(270/1 522)，復(fù)治患者總耐藥率為22.01%(46/209)，初、復(fù)治耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.245，P>0.05)。在6種受試藥物中，INH的耐藥率最高，為10.05%(174/1 731)。其余5種藥物耐藥率從高到低依次是SM(9.01%)、OFX(4.74%)、RFP(3.24%)、EMB(2.14%)、KM(0.35%)，6種藥物的初治耐藥率和復(fù)治耐藥率高低排序不變。1 731株結(jié)核分枝桿菌中，14.96%(259/1 731)對(duì)一線藥物耐藥；4.97%(86/1 731)對(duì)二線藥物耐藥；單耐藥、多耐藥、耐多藥、廣泛耐藥、利福平耐藥的耐藥率分別是11.84%(205/1 731)、3.81%(66/1 731)、2.60%(45/1 731)、0.06%(1/1 731)、3.24%(56/1 731)。見表1。

表1 1 731株結(jié)核分枝桿菌的耐藥率Tab.1 Drug resistance rates of 1 731 M. tuberculosis strains

2.3 結(jié)核分枝桿菌耐藥譜 在28種耐藥譜中(表2)，耐2、3、4、5種藥的組合中優(yōu)勢(shì)耐藥譜分別為INH+SM(2.43%)、INH+RFP+SM(0.58%)、INH+RFP+SM+EMB(0.58%)、INH+RFP+SM+EMB+OFX(0.58%)。有1例復(fù)治病人對(duì)6種藥物均耐藥。

表2 耐藥結(jié)核分枝桿菌的耐藥譜Tab.2 Drug resistance spectrum of drug-resistant M. tuberculosis

2.4 不同臨床特征的肺結(jié)核患者的耐藥情況分析

1 731例檢出結(jié)核分枝桿菌病例中，男性1 245例(71.92%)，女性486例(28.08%)，其中男女性患者的任一藥物耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.427，P>0.05)，男性患者耐多藥率顯著高于女性(χ2=8.423，P<0.05)。從患者年齡層次看，60周歲以上患者有830例，占比最高(47.95%)。不同年齡段對(duì)任一藥物的耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.114,P<0.05)，0～20歲患者任一藥物耐藥率最低(8.1%)；不同年齡段耐多藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.417，P>0.05)。見表3。

表3 不同臨床特征的肺結(jié)核患者的耐藥情況分析Tab.3 Analysis of clinical drug resistance of patients with tuberculosis with various clinical characteristics

2.5 不同地區(qū)耐藥率分析 在7個(gè)區(qū)縣中，臨安區(qū)總耐藥率、初治耐藥率最高，富陽區(qū)初治耐多藥率最高，建德市復(fù)治耐藥率、總耐多藥率、復(fù)治耐多藥率最高。淳安縣總耐藥率、初治耐藥率最低。蕭山區(qū)初治、復(fù)治、總耐多藥率均最低，有4個(gè)區(qū)縣的復(fù)治耐多藥率都為0。見表4。

表4 2018-2019年杭州市不同地區(qū)結(jié)核耐藥率分析Tab.4 Analysis of TB drug resistance rates in different counties of Hangzhou in 2018-2019

2.6 2011年、2015年、2018-2019年耐藥率變化分析 對(duì)比2011年、2015年、2018-2019年這3個(gè)時(shí)間段的數(shù)據(jù)(表5)，其中，2011年、2015年數(shù)據(jù)來源于文獻(xiàn)[3]。一線藥物、RFP、SM的總耐藥率、初治患者耐藥率及復(fù)治患者耐藥率以及耐多藥、INH、EMB的總耐藥率及復(fù)治耐藥率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(均P<0.05)。但2018-2019年二線藥物OFX的總耐藥率和初治患者耐藥率較2015年升高(均P<0.05)。

表5 2011年、2015年、2018-2019年杭州市縣域結(jié)核病人耐藥率變化分析Tab.5 Trends in drug resistance prevalence among patients with tuberculosis in suburban Hangzhou in 2011, 2015 and 2018-2019

3 討 論

世衛(wèi)組織2020年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2019年全球新發(fā)結(jié)核病患者中MDR/RR的占比是3.3%，復(fù)治患者M(jìn)DR/RR的占比是18%，我國(guó)的數(shù)據(jù)分別是7.1%和23%[2]。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)回顧性研究顯示，2014-2018年的總耐多藥率為14.6%[8]。國(guó)內(nèi)其他地區(qū)近年的報(bào)道顯示：貴州的總耐多藥率為14.3%[9]；四川的總耐多藥率為13.3%[10]；河北的總耐多藥率為13.2%[11]；北京的總耐多藥率為9%[12]；上海的總耐藥多率為5%[13]；陜西省研究965株MTB的耐多藥率為6.53%[14]；天津市研究2006—2017年20 212株MTB的耐多藥率為12.29%[15]。杭州市2018-2019年初復(fù)治患者的MDR/RR均低于全球和全國(guó)平均水平。

2011年、2015年、2018-2019年杭州市結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院收治的結(jié)核病人的耐藥率呈下降趨勢(shì)(表5)。復(fù)治病人除OFX和KM以外的耐藥率均呈下降趨勢(shì)。2018-2019年初、復(fù)治病人對(duì)不同藥物的耐藥率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這在之前的研究中較為少見。杭州市從2016年加入中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)與蓋茨基金會(huì)結(jié)核病防治合作項(xiàng)目三期(中蓋結(jié)核病三期)，積極推廣結(jié)核病分子診斷技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了分子診斷技術(shù)區(qū)縣范圍全覆蓋，使得耐多藥結(jié)核病的診斷時(shí)間從2個(gè)月縮短至2 h，大大提高了耐藥結(jié)核病的診療技術(shù)，降低了耐藥率。上海的一項(xiàng)研究顯示，傳播是引起耐藥結(jié)核病的主要原因[16]。另一項(xiàng)研究也顯示60%的耐多藥病人是傳播所致[17]。杭州市開展的DOTS-PLUS項(xiàng)目，為耐藥結(jié)核病的診斷、管理、治療提供了新的策略：一方面，從一定程度上阻斷了耐藥病人的傳播；其次，診斷、治療水平的提升，減少了獲得性耐藥的發(fā)生；再次，杭州市區(qū)縣定點(diǎn)醫(yī)院的復(fù)治病人比例逐年降低，從2013-2016年的17.22%[18]、2017年的14.37%[4]，下降到2018-2019年的12.07%，隨著交通便利，部分復(fù)治病人會(huì)選擇去市級(jí)定點(diǎn)醫(yī)院就醫(yī)，也是復(fù)治病人耐藥率下降的一個(gè)原因。

對(duì)于利福平敏感肺結(jié)核的治療，使用一線抗結(jié)核藥物治療。本研究中，4種一線藥物耐藥率最高的是異煙肼(10.05%)，其次是鏈霉素(9.01%)，但這兩種藥物的耐藥率2018-2019年相較于2011年和2015年均下降(異煙肼：χ2=52.270，P<0.05；鏈霉素：χ2=43.003，P<0.05)。這說明目前采用聯(lián)合用藥降低耐藥率的方法是有效的。二線藥物中氧氟沙星的耐藥率高達(dá)4.7%，相對(duì)于2015年(2.6%)升高(χ2=8.976，P<0.05)。2020版《中國(guó)結(jié)核病預(yù)防控制工作技術(shù)規(guī)范》[19]關(guān)于利福平耐藥患者的治療方案，左氧氟沙星、莫西沙星是首選藥物。本研究中，同時(shí)耐利福平和氧氟沙星的耐藥率為0.81%，而利福平的耐藥率是3.24%，即每4個(gè)利福平耐藥患者中，有1個(gè)患者耐氧氟沙星，這個(gè)比例值得臨床醫(yī)生關(guān)注。

從結(jié)核病患者年齡層次看，60歲以上結(jié)核病患者占比最大(47.95%)。我國(guó)的人口老齡化程度進(jìn)一步加深，第七次人口普查顯示我國(guó)60歲及以上人口已超2.64億，占總?cè)丝诘?8.70%。老年人免疫力下降，基礎(chǔ)疾病較多，更易患結(jié)核病。這提示我們要重點(diǎn)防控老年人結(jié)核病。研究顯示不同年齡階段對(duì)任一藥物的耐藥率存在差異，40～60歲最高，0～20歲最低；而對(duì)于任一藥物耐藥，男女不存在差異，但對(duì)于耐多藥患者，男性高于女性。江蘇連云港的一項(xiàng)研究也顯示對(duì)任一藥物耐藥率，28～54歲的最高，0～28歲最低，但性別對(duì)于耐藥沒有差異[20]。

不同地區(qū)耐藥率分析提示我們要重點(diǎn)關(guān)注富陽區(qū)，臨安區(qū)耐藥病人的管控。尤其是富陽區(qū)初治耐多藥率最高，從該區(qū)分離的耐多藥病人57.14%居住地為同一街道。我們擬對(duì)2018年以后分離自富陽區(qū)的耐多藥結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行全基因組測(cè)序，從基因組角度進(jìn)行溯源。 建德市復(fù)治耐藥率、復(fù)治耐多藥率較高，提示我們?cè)诙綄?dǎo)時(shí)要重點(diǎn)關(guān)注定點(diǎn)醫(yī)院的診療能力和病人的依從性。

利益沖突：無

引用本文格式：黃銀燕，吳亦斐，賈慶軍，等. 杭州市1 731株結(jié)核分枝桿菌耐藥狀況分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：410-416，422. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.048