劉江楓

（福州市于山風(fēng)景名勝公園管理處，福建 福州 350001）

0 引言

【研究意義】鐮翅羊耳蒜（Liparis bootanensis）隸屬于蘭科（Orchidaceae）羊耳蒜屬，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶區(qū)域，常附生于林中樹(shù)干和巖壁上[1]，已被列入國(guó)家II 級(jí)重點(diǎn)保護(hù)（第二批，討論稿）和CITS 附錄II（http://www.iplant.cn/rep/protlist）植物中。物種在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，傾向于使用某種或某幾種同義密碼子，形成了密碼子偏好性（Coden usage bias）。葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的細(xì)胞器，其基因組具有母系遺傳、拷貝數(shù)多、表達(dá)效率高、遺傳相對(duì)保守等特點(diǎn)，可作為理想的轉(zhuǎn)化載體，具有明顯的高表達(dá)優(yōu)勢(shì)[2,3]。因此，通過(guò)鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子分析，將為鐮翅羊耳蒜系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳轉(zhuǎn)化和制定保育策略提供基礎(chǔ)依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】鐮翅羊耳蒜具有較高的藥用價(jià)值，為我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物[4]，具有解熱止咳、止血、止痛作用[5-6]。目前，對(duì)于鐮翅羊耳蒜的研究主要有化學(xué)成分、繁殖生物學(xué)和葉綠體基因組等方面[7-9]。密碼子偏好性在不同物種、組織或基因中存有多樣性，受多種因素影響，但突變和選擇是影響密碼子偏好性形成的主要因素[10-15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于鐮翅羊耳蒜的遺傳學(xué)研究較少，其葉綠體基因組密碼子尚待進(jìn)一步研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子組成、偏好性及影響因素進(jìn)行分析，并確定最優(yōu)偏愛(ài)密碼子。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組數(shù)據(jù)來(lái)源于NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank 收錄號(hào)為MN627759），全長(zhǎng)為158 325 bp，其中GC 含量為36.9%，共包含有83 條CDS[9]。根據(jù)基因組注釋信息，為減少樣本誤差，首先使用Seqkit剔除重復(fù)序列，然后選擇以ATG 為起始密碼子，以TAA、TAG、TGA 為終止密碼子，且編碼區(qū)序列長(zhǎng)度超過(guò)300 bp 的基因序列，共得到47 條CDS。

1.2 研究方法

基因的總GC 含量（GCall）、密碼子第1、第2 和第3 位的GC 含量（GC1、GC2 和GC3）通過(guò)CUSP（http://emboss.toulouse.inra.fr/cgi-bin/emboss/cusp）計(jì)算；相對(duì)同義密碼子使用度（Relative synonymous condon usage，RSCU），有效密碼子數(shù)（Effective number of Codon,ENC）通 過(guò)CodonW（http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=codonw）計(jì)算。運(yùn)用SPSS 25.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析。以GC3 為橫坐標(biāo)，GC12（GC1 和GC2 的平均值）為縱坐標(biāo)做中性繪圖分析；以GC3s（同義密碼子第3 位GC 含量）為橫坐標(biāo)，ENC 值為縱坐標(biāo)，繪制ENCPlot 二維散點(diǎn)圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為ENC=2+GC3+29/[GC32+（1-GC3）2]，并結(jié)合ENC 比值分布進(jìn)行分析；以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)、A3/（A3+T3）為縱坐標(biāo)繪制二維散點(diǎn)圖，進(jìn)行RP2 偏倚分析；通過(guò)上述分析以確定鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子的使用偏性的規(guī)律[16-19]。通過(guò)高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子分析，以兩者共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成分析

由表1 可知，47 條葉綠體蛋白編碼基因密碼子3 個(gè)堿基平均GC 含量為38.13%，GC3 為27.99%，低于GC1（47.00%）和GC2（39.41%），表明密碼子不同位置上GC 含量不同，以A 或T 堿基結(jié)尾的密碼子使用頻率較高；ENC 值范圍為40.85～56.80，平均值為47.27，表明鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子偏好性較弱。

表1 編碼基因密碼子不同位置GC 含量Table 1 GC content in various positions of codon in chloroplast gene

通過(guò)密碼子參數(shù)相關(guān)性分析，由表2 可知，GCall與GC1、GC2、GC3 之間均呈極顯著相關(guān)（r=0.802，P＜0.01；r=0.758，P＜0.01；r=0.396，P＜0.01）。GC1與GC2 呈極顯著相關(guān)（r=0.390，P＜0.01），GC3 與GC1、GC2 均無(wú)顯著相關(guān)（r=0.047，P＞0.05；r=0.035，P＞0.05），說(shuō)明密碼子第1 和第2 位的堿基組成相似，與第3 位堿基組成存在差異。ENC 與GC1、GC2之間均無(wú)顯著相關(guān)（r=0.022，P＞0.05；r=-0.277，P＞0.05），與GC3 呈極顯著正相關(guān)（r=0.455，P＜0.05），說(shuō)明密碼子第3 位堿基組成對(duì)密碼子偏好性影響較大；ENC 和密碼子數(shù)目（N）之間無(wú)顯著相關(guān)（r=0.196，P＞0.05），表明N 對(duì)ENC 的影響較弱。

表2 編碼基因密碼子參數(shù)的相關(guān)性Table 2 Correlations among individual related parameters of genes

由表3 可知，RSCU＞1 的密碼子共有30 個(gè)，其中僅有1 個(gè)密碼子以G 結(jié)尾，其余29 個(gè)密碼子皆為以A 或U 結(jié)尾；RSCU＜1 的密碼子共有16 個(gè)，其中3 個(gè)密碼子以G 或C 結(jié)尾，其余13 個(gè)皆為以A 或U 結(jié)尾。

表3 相對(duì)同義密碼子使用度分析Table 3 RSCU analysis on protein coding region

2.2 中性繪圖分析

由圖1可知，GC12值范圍為0.312 0～0.525 8，GC3值范圍為0.189 4～0.373 4。GC12 與GC3 的相關(guān)性不顯著（r=0.05，P＞0.05），回歸系數(shù)為0.064 9，表明密碼子第1、2 位和第3 位堿基組成存在差異，密碼子偏好性主要受到選擇的影響，突變作用較弱。

圖1 中性繪圖分析Fig.1 Neutrality plot

2.3 ENC-plot 繪圖分析

由圖2 可知，大部分基因落在期望曲線的附近兩側(cè)，表明ENC 實(shí)際值與ENC 預(yù)期值之間較為接近。通過(guò)ENC 比值頻數(shù)分布進(jìn)一步分析，由表4 可知，47%基因的ENC 比值頻數(shù)分布在-0.05～0.05 區(qū)間，即有22 個(gè)基因ENC 值與預(yù)期ENC 值接近，表明這部分基因密碼子偏好性更多地受突變的影響，而受選擇的影響較弱；其他53%基因的ENC 比值頻數(shù)分布在-0.05～0.05 區(qū)間之外，即有25 個(gè)基因與預(yù)期ENC 值相差較遠(yuǎn)，表明這部分基因密碼子偏好性更多受選擇的影響，而受突變的影響較弱。

表4 ENC 比值頻數(shù)分布Table 4 Distribution of ENC ratios

圖2 ENC-plot 繪圖分析Fig.2 ENC-plot

2.4 PR2-plot 繪圖分析

由圖3 可知，多數(shù)基因處于平面圖的下半部，尤其右下方，說(shuō)明從使用頻率方面來(lái)看，A＞T、G＞C。如果4 個(gè)堿基的使用頻率相當(dāng)，則密碼子偏好性完全受突變因素影響，因此，鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子偏好性除了受突變因素影響外，還受到選擇等因素的共同影響。

2.5 最優(yōu)密碼子分析

由表5 可知，通過(guò)高表達(dá)優(yōu)越密碼子分析法得到的△RSCU＞0.08 的有25 個(gè)密碼子，其中有6 個(gè)密碼子以A 結(jié)尾，11 個(gè)密碼子以U 結(jié)尾，2 個(gè)密碼子以G 結(jié)尾，6 個(gè)密碼子以C 結(jié)尾。結(jié)合高頻密碼子分析，最后確定17 個(gè)最優(yōu)密碼子，分別為UUU、UUG、CUU、AUU、GUU、UAU、GAA、UCU、CCU、ACU、ACA、GCA、CGU、CGA、AGU、AGA、GGU。

表5 最優(yōu)密碼子分析Table 5 Analysis on preferred codon

續(xù)上表

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組47 條CDS 的不同位置GC 含量，結(jié)果顯示密碼子3 個(gè)堿基平均GC 含量為38.13%，與鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組GC 含量（36.9%）[9]較為接近。GC3 為27.99%，低于GC1（47.00%）和GC2（39.41%），表明鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組中以A 或T 堿基結(jié)尾的密碼子使用頻率較高，這與沙棗[15]、苦蕎[20]、蝴蝶蘭[21]、文心蘭[22]、糜子[23]等植物葉綠體基因組密碼子組成分析結(jié)果一致。

GC3 常被作為密碼子使用模式分析的重要依據(jù)[21,24]。本研究通過(guò)相關(guān)性和中性繪圖分析顯示密碼子第1 和第2 位的堿基組成較相似，與第3 位堿基組成存在差異，表明突變對(duì)鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子偏好性影響較弱，可能更多受選擇影響。通過(guò)ENC-plot 分析和PR2-plot 繪圖分析，表明鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子偏好性除了受到突變因素影響外，還受到選擇等因素的共同影響。因此，綜上分析，本研究認(rèn)為鐮翅羊耳蒜葉綠體基因組密碼子偏好性主要受突變和選擇作用共同影響，同時(shí)還受其他因素影響，是多因素綜合影響的結(jié)果[23,25]。

本研究通過(guò)高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子分析，以兩者共有的密碼子作為最優(yōu)密碼子，共計(jì)有17 個(gè)密碼子，其中5 個(gè)密碼子以A 結(jié)尾，11 個(gè)密碼子以U 結(jié)尾，僅1 個(gè)密碼子以G 結(jié)尾，為今后通過(guò)對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，提高表達(dá)效率，改良鐮翅羊耳蒜奠定基礎(chǔ)。