余明興，林裕勝

（1.福建省浦城縣動物疫病預(yù)防控制中心，福建 浦城 353400；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】2017 年以來，我國江蘇、河南、河北、廣東、福建、安徽、浙江等多省養(yǎng)鵝場暴發(fā)了由新型鵝星狀病毒引起的雛鵝痛風病。該病主要發(fā)生于5～20 日齡雛鵝，臨床癥狀主要表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、消瘦、精神沉郁、采食量下降，剖檢可見腎臟、肝臟及關(guān)節(jié)處有尿酸鹽沉積，其發(fā)病率在30%左右，死亡率最高可達50%[1-3]，給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。福建省是鵝星狀病毒病的首發(fā)疫區(qū)之一。鑒于目前市面上尚無可預(yù)防或治療該病的相關(guān)疫苗或藥物，使得該病的防控異常困難。因此，建立一種快速檢測新型鵝星狀病毒的檢測方法對于該病早期診斷顯得尤為重要。【前人研究進展】鵝星狀病毒屬于星狀病毒科（Astroviridae）禽星狀病毒屬（Avastrovirus），經(jīng)基因組解析后發(fā)現(xiàn)與火雞星狀病毒和鴨星狀病毒有明顯不同，屬于新的基因型，因此當前命名為新型鵝星狀病毒[4-5]。目前新型鵝星狀病毒的診斷方法主要有分離鑒定法、電鏡觀察法、常規(guī)PCR 法、LAMP 法和熒光定量PCR 法[6]。分離鑒定法主要通過接種鵝胚或鵝胚腎細胞，一般需要傳至3 代左右才可出現(xiàn)鵝胚死亡或出現(xiàn)明顯病變，比較耗費時間。電鏡觀察法是星狀病毒早期的檢測方法之一，然而Yuan等[7]使用鵝肝臟超薄切片進行觀察，卻無法觀察到星狀病毒特有的形態(tài)，因此該方法存在一定的缺陷。在分子診斷技術(shù)方面，前人也進行了相關(guān)研究，如張玉霞等[8]基于ORF1b基因建立的LAMP 檢測方法，邱思語等[9]基于ORF1b建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法，白彩霞等[10]基于ORF2 建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法，Yuan 等[11]基于ORF1b建立的TaqMan 實時熒光定量RT-PCR 方法。分子生物學方法是目前病原檢測應(yīng)用最廣泛的一種方法，尤其是PCR 技術(shù)，因能檢測到微量的病原DNA 而常應(yīng)用于病原體的早期檢測，與分離培養(yǎng)法、電鏡分離法、ELISA 法和免疫熒光檢測法等相比具有一定優(yōu)勢[12]。姜勝男等[13]、蒲路莎等[14]研究表明當前流行的新型鵝星狀病毒毒株之間ORF2 核苷酸編碼的氨基酸同源性高達99.4%以上，保守性較高，適合作為病原診斷靶基因?！颈狙芯壳腥朦c】為進一步擴展新型鵝星狀病毒的檢測方法，本研究根據(jù)新型鵝星狀病毒ORF2基因為靶基因建立新型鵝星狀病毒 RTPCR 檢測方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用Oligo 7 軟件設(shè)計并篩選出1 對特異性引物，建立適用于檢測新型鵝星狀病毒的RT-PCR 方法，為新型鵝星狀病毒病臨床樣品的快速檢測和流行病學調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 毒株及臨床樣品 新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus,ARV）、鵝細小病毒（Goose parvovirus,GPV）、鵝多瘤病毒（Goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV）、鵝圓環(huán)病毒（Goose vircovirus,GoCV）和新型鵝星狀病毒等DNA 或cDNA 由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所動物病毒研究室提供。45 份臨床樣品于2019–2020 年期間采自福建省浦城縣，均為臨床上疑似鵝痛風的脾、腎組織和關(guān)節(jié)液，發(fā)病鵝表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大，剖檢腎臟表面可見大量尿酸鹽沉積。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA/DNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ex TaqDNA 聚合酶、DL2000、DL1000 Marker 均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計合成 根據(jù)GenBank 登錄的新型鵝星狀病毒SDXT 株（No.MN399857）ORF2 基因序列，利用Oligo 7 軟件設(shè)計并篩選出1 對特異性引物，引物的核苷酸序列為：P1:5′-ATGAAGGCCGAGAG GAAGCTT -3′；P2：5′-GTTCAAGATGCGGCCGA GC -3′。擴增片段大小為384 bp。引物由福州博尚生物有限公司合成。

1.2.2 核酸抽提 利用病毒DNA/RNA 提取試劑盒、參照說明書分別提取供試病毒和臨床樣品的DNA 和RNA，用作PCR 反應(yīng)的模板。

1.2.3 反應(yīng)條件及優(yōu)化 cDNA 合成按照全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊進行。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 終止反應(yīng)。PCR 擴增采用 25 μL 體系，Premix 12.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 2 μL，上下游引物濃度采用矩陣法在0.4～1.2 μmol·L-1調(diào)整，無菌去酶水補足20 μL。PCR 反應(yīng)程序：擴增條件為 95 ℃ 5 min 熱啟動，94 ℃變性15 s，退火溫度在50 ℃～60 ℃調(diào)整 15 s，72 ℃延伸15 s，35 個循環(huán)，72 ℃ 延伸 7 min。待反應(yīng)結(jié)束后取 PCR 產(chǎn)物 7 μL，1.5%瓊脂凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)掃描儀下觀察拍照。擴增的特異性片段割膠回收后純化，再送測序公司測序，通過Blast比對驗證擴增片段的正確性。

1.2.4 特異性試驗 應(yīng)用建立的 RT--PCR 方法擴增新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒，檢驗建立方法的特異性效果。

1.2.5 敏感性試驗 將反轉(zhuǎn)錄得到的新型鵝星狀病毒cDNA（原液濃度為62 ng·μL-1）進行10 倍遞增稀釋，共稀釋成9 個濃度梯度，分別為6.2 ng·μL-1、620 pg·μL-1、62 pg·μL-1、6.2 pg·μL-1、620 fg·μL-1、62 fg·μL-1、6.2 fg·μL-1、620 ag·μL-1、62 ag·μL-1，利用優(yōu)化好的方法進行擴增，檢驗該方法的敏感性。

1.2.6 重復(fù)性試驗 利用建立的新型鵝星狀病毒RTPCR 方法對3 份新型鵝星狀病毒分離株cDNA 進行 3次 RT--PCR 擴增。進行批內(nèi)重復(fù)試驗時，每次樣品均設(shè)3 個重復(fù)；進行批間重復(fù)試驗時，3 份新型鵝星狀病毒cDNA 樣品間隔5 d 檢測1 次，共檢測3 次。

1.2.7 RT-PCR 方法初步應(yīng)用 利用建立的RT-PCR方法對從浦城采集的45 份臨床樣品進行檢測，同時設(shè)置新城疫病毒和鵝細小病毒做陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及擴增產(chǎn)物的鑒定

RT-PCR 最佳反應(yīng)體系為：Premix 10 μL，ORF2上下游引物濃度10 μmol·L-1各1 μL，模板3 μL，無菌去離子水補足至20 μL。最佳反應(yīng)程序為：94 ℃2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，30 個 循環(huán)；72 ℃ 10 min。應(yīng)用優(yōu)化后的體系對新型鵝星狀病毒進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示，新型鵝星狀病毒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴增出1 條約380 bp 的目的片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。測序結(jié)果顯示，RT-PCR 擴增的新型鵝星狀病毒ORFV基因序列長度為384 bp，與參考的MN399857 株序列同源性為99.8%，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 新型鵝星狀病毒ORF2 基因的RT-PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Amplification on ORF2 of NGAstV by RT-PCR

2.2 特異性擴增

利用建立的RT-PCR 檢測方法對新型鵝星狀病毒、新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒的核酸進行檢測，同時設(shè)置空白對照。結(jié)果顯示，僅新型鵝星狀病毒擴增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，而新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒和去離子水樣品均為陰性（圖2），表明建立的RTPCR 方法具有良好的特異性。

圖2 新型鵝星狀病毒RT-PCR 特異性試驗結(jié)果Fig.2 Specificity of NGAstV detection by RT-PCR

2.3 敏感性試驗

新型鵝星狀病毒核酸反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 濃度為62 ng·μL-1，以10倍系列稀釋成6.2 ng·μL-1、620 pg·μL-1、62 pg·μL-1、6.2 pg·μL-1、620 fg·μL-1、62 fg·μL-1、6.2 fg·μL-1、620 ag·μL-1、62 ag·μL-1進行PCR敏感性試驗，結(jié)果顯示：建立的新型鵝星狀病毒RTPCR 方法的檢測限均為62 fg·μL-1（圖3）。

圖3 RT-PCR 敏感性試驗Fig.3 Sensitivity of RT-PCR assay

2.4 重復(fù)性試驗

利用建立的新型鵝星狀病毒RT-PCR 方法對3 份新型鵝星狀病毒陽性樣品，新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒各1 份作陰性對照進行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間試驗結(jié)果均一致（圖略），即除了3 份新型鵝星狀病毒陽性樣品有擴增條帶，其余樣品均無擴增條帶，表明重復(fù)性好。

2.5 臨床樣品檢測結(jié)果

利用建立的RT-PCR 方法對45 份臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，45 份樣品中新型鵝星狀病毒共檢測出15 份，陽性率為33.33%（15/45），表明該病在浦城縣流行較為嚴重，應(yīng)引起重視，圖4 為部分臨床樣品檢測結(jié)果。

圖4 部分臨床樣品RT-PCR 檢測結(jié)果Fig.4 Detection of NGAstV on clinical samples by RT-PCR assay

3 討論與結(jié)論

星狀病毒在我國水禽群體中分布地域廣泛且宿主范圍寬廣，能夠引起雞的腎炎、鴨的病毒性肝炎、火雞腸炎等。鵝的星狀病毒病是近年來通過多位學者[15-16]研究才確認的，然而目前對該病的致病機理尚不明確，缺乏有效的商品化疫苗，導(dǎo)致該病給養(yǎng)鵝業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。福建省南平市是養(yǎng)鵝大市，因該病給養(yǎng)鵝戶造成的經(jīng)濟損失較為嚴重。為了更好地對福建省新型鵝星狀病毒病有更好的了解，為養(yǎng)殖戶提供更為快速便捷的檢測結(jié)果，建立一種用于檢測新型鵝星狀病毒的RT-PCR 方法顯得尤為重要。

隨著規(guī)?；B(yǎng)殖場的不斷發(fā)展，當前多種疫病臨床癥狀十分接近，剖解病變相差無幾，不利于精準確定病因，耽誤最佳治療時間。分子生物學檢測技術(shù)已然成為輔助臨床診斷的主要方法。PCR 技術(shù)是目前所有動物疫病中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，與熒光定量PCR 技術(shù)相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，而且操作流程簡單，適合于基層工作者使用。

目前建立鵝星狀病毒的分子診斷技術(shù)有張玉霞等[8]基于ORF1b基因建立的LAMP 檢測方法，其靈敏度為1 ng·μL-1；邱思語等[9]基于ORF1b建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為24.2 拷貝·μL-1，白彩霞等[10]基于ORF2 基于建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為3.75 拷貝·μL-1，Yuan 等[11]基于ORF1b建立的TaqMan 實時熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為52.5 拷貝·μL-1。本研究根據(jù)新型鵝星狀病毒ORF2 基因設(shè)計1 對特異性的引物，通過對引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立了新型鵝星狀病毒RT-PCR 檢測方法，其靈敏度為62 fg·μL-1，與邱思語等[9]、白彩霞等[10]、Yuan 等[11]建立熒光定量PCR 方法相比其靈敏性相距較遠，但與張玉霞等[8]建立的LAMP 方法相比，本研究建立的方法靈敏度高100 倍。此外，本研究建立的方法對鵝常見病毒均未有檢測出，表明特異性強；通過批內(nèi)、批間重復(fù)驗證結(jié)果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性。通過對45 份臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示15 份樣品陽性，陽性率為33.33%，提示新型鵝星狀病毒病應(yīng)當引起當?shù)赜嘘P(guān)部門重視。

本研究成功建立了新型鵝星狀病毒RT-PCR 檢測方法，其特異性強、穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于臨床樣品的檢測，為及時控制該病提供有效的方法。