李玲麗，李文杰，張 銀，李夢(mèng)希，孫 兵，費(fèi)永俊

（1.長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.深圳園林股份有限公司，廣東 深圳 518000）

0 引言

【研究意義】酸雨是指pH 值小于5.6 的大氣降水[1]。在我國(guó)，由于幾十年的煤炭等地下資源開(kāi)采及秸稈焚燒，大量的SO2等物質(zhì)排放到大氣中，使得超40%的國(guó)土受到酸雨危害，是繼歐洲、北美之后出現(xiàn)的世界第三大酸雨區(qū)，形成了華中、西南、華南和華東四大酸雨區(qū)，其中四川、安徽、湖北、湖南、江西、福建、廣西和重慶的大部分地區(qū)是中國(guó)的主要酸雨分布區(qū)[2]。酸雨極強(qiáng)的淋溶性會(huì)降低植物體內(nèi)光合色素含量[3]和水分利用效率[4]，導(dǎo)致光合作用受到制約，影響植物生長(zhǎng)。不同物種對(duì)酸雨脅迫的耐受性不同[5]。紅豆杉屬（Taxus）植物作為世界公認(rèn)的珍稀瀕?？拱?shù)種[6]，探究其響應(yīng)酸雨脅迫的生理表現(xiàn)，有助于進(jìn)一步研究其對(duì)酸雨的抗性，這對(duì)紅豆杉屬植物的資源保護(hù)十分重要。【前人研究進(jìn)展】目前，許多學(xué)者已對(duì)紅豆杉屬植物的群落結(jié)構(gòu)[7-8]、遺傳多樣性[9-11]、紫杉醇含量[12]、原生質(zhì)體培養(yǎng)[13]進(jìn)行了研究，前人對(duì)紅豆杉屬植物的研究主要集中在遺傳學(xué)方面?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】雖然對(duì)紅豆杉屬植物的抗酸性已有部分研究[14-15]，但尚不深入?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析不同pH 值的模擬酸雨對(duì)紅豆杉和云南紅豆杉葉片各生理指標(biāo)的影響，以期選出對(duì)酸雨耐受性較強(qiáng)的物種，為酸雨災(zāi)害地區(qū)紅豆杉屬植物的管理養(yǎng)護(hù)以及應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為2 年生紅豆杉（Taxus chinensis）和云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）幼苗，由長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院提供，栽植于長(zhǎng)江大學(xué)西校區(qū)盆景園內(nèi)。

1.2 方法

按照H2SO4與HNO3（v∶v）8∶1 的比例配制模擬酸雨母液。再用蒸餾水稀釋配制成pH 值分別為3.0、3.5、4.0、4.5 的溶液。選擇各100 株生長(zhǎng)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致的紅豆杉和云南紅豆杉幼苗進(jìn)行模擬酸雨脅迫處理。于傍晚對(duì)供試植物幼苗葉片均勻噴霧500 mL 不同pH 值的溶液，以噴施pH 值5.6 的等體積蒸餾水作對(duì)照（CK），直至有水滴滴落為止，每處理8 株，重復(fù)3 次，隨機(jī)排列于溫室苗圃?xún)?nèi)培養(yǎng)。待酸雨脅迫處理10 d 后，立即進(jìn)行取材，不同處理分別取足量葉片，放入液氮密封保存，然后放入-80 °C 冰箱備用。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

參考鄒琦[16]的方法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過(guò)氧化氫酶（CAT）活性、葉綠素（CHL）含量和類(lèi)胡蘿卜素（CAR）含量；參考Nakno 等[17]的方法測(cè)定抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活性；參考Anderson 等[18]的方法測(cè)定多酚氧化酶（PPO）活性；參考李合生[19]的方法測(cè)定丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量和可溶性糖（SS）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，通過(guò)Duncan法多重比較，顯著性水準(zhǔn)為a=0.05，利用Excel 軟件進(jìn)行作圖，采用模糊數(shù)學(xué)的隸屬函數(shù)值法[20]對(duì)紅豆杉和云南紅豆杉的各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

隸屬函數(shù)值計(jì)算公式：

如果為負(fù)相關(guān)，計(jì)算公式為：

式中，Zij為i組別j指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xij為i組別j指標(biāo)的測(cè)定值；Xi max和Ximin分別為各組別指標(biāo)值的最大值和最小值。累加各物種各指標(biāo)的具體隸屬值，并求出平均值后進(jìn)行比較排名。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬酸雨對(duì)供試植物葉片抗氧化酶活性的影響

如圖1 所示，隨著pH 值的減小，紅豆杉葉片POD 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)比對(duì)照提升72.33%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低4.31%。云南紅豆杉葉片POD 活性隨pH 值的減小呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5、3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低67.52%。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片POD 活性，pH 值4.5 的模擬酸雨能顯著提升紅豆杉葉片POD 活性，顯著降低云南紅豆杉葉片POD 活性。

圖1 酸雨脅迫對(duì)紅豆杉屬植物葉片抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of acid rain stress on antioxidant enzyme activity in leaves of T. chinensis and T.yunnanensis

隨著pH 值的減小，紅豆杉葉片CAT 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)比對(duì)照提升28.63%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為4.0、3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低54.79%。云南紅豆杉葉片CAT 活性整體呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.0時(shí)比對(duì)照提升25.01%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為4.5、3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低49.31%。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片CAT 活性，pH 值4.5 和pH 值4.0 的模擬酸雨分別顯著提升紅豆杉和云南紅豆杉葉片CAT 活性。

隨著pH 值的減小，紅豆杉和云南紅豆杉的葉片PPO 活性均呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5時(shí)，相比對(duì)照分別提升107.67%和133.67%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)，相比對(duì)照分別下降72.34%和74.27%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片PPO 活性，pH 值4.5 的模擬酸雨能顯著提升2 種植物葉片PPO 活性。

隨著pH 值的減小，紅豆杉葉片APX 活性呈先下降后上升再下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.0 時(shí)比對(duì)照提升13.19%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為4.5、3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低54.62%。隨著pH 值的減小，云南紅豆杉葉片APX 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)比對(duì)照提升38.17%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低34.87%。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片內(nèi)的APX 活性，pH 值4.0 和pH 值4.5 的模擬酸雨分別顯著提升紅豆杉和云南紅豆杉葉片APX 活性。

隨著pH 值的減小，紅豆杉和云南紅豆杉的葉片SOD 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)，相比對(duì)照分別提升23.88%和87.02%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)，相比對(duì)照分別降低7.88%和22.40%，后者與對(duì)照差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能降低2 種植物葉片SOD 活性，pH 值4.5 的模擬酸雨能顯著提升2 種植物葉片SOD 活性。

2.2 模擬酸雨對(duì)供試植物葉片MDA、CHL 和CAR含量的影響

如圖2 所示，紅豆杉和云南紅豆杉的葉片MDA含量隨pH 值的減小呈上升趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)升至最高，相比對(duì)照分別提升37.68%和79.24%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著增加2 種植物葉片MDA 含量。

圖2 酸雨脅迫對(duì)紅豆杉屬植物葉片MDA、CHL、CAR 含量的影響Fig.2 Effects of acid rain stress on MDA,CHL,and CAR contents in leaves of T. chinensis and T.yunnanensis

隨著pH 值的減小，紅豆杉葉片CHL 含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)比對(duì)照提升24.56%，差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為4.0、3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低27.18%；云南紅豆杉葉片CHL 含量隨pH 值的減小呈下降趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為3.5 和3.0 時(shí)均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0時(shí)比對(duì)照降低31.27%。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片內(nèi)的CHL 含量，pH 值4.5 的模擬酸雨能顯著提升紅豆杉葉片CHL 含量。

隨著pH 值的減小，紅豆杉葉片CAR 含量呈下降趨勢(shì)。酸雨處理均比對(duì)照顯著降低（P＜0.05），其中pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低19.46%；云南紅豆杉葉片CAR 含量隨pH 值的減小呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)比對(duì)照提升1.06%，當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)比對(duì)照降低24.98%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值4.5 的模擬酸雨能顯著提升云南紅豆杉葉片CAR 含量，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片CAR 含量。

2.3 模擬酸雨對(duì)供試植物葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3 所示，隨著pH 值的減小，紅豆杉和云南紅豆杉葉片SS 含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 和4.0 時(shí)顯著提升（P＜0.05），pH 值為3.5 和3.0 時(shí)顯著降低（P＜0.05）。其中：當(dāng)pH 值為4.0時(shí)紅豆杉和云南紅豆杉葉片SS 含量分別比對(duì)照提升48.63%和69.41%，當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)紅豆杉和云南紅豆杉葉片SS 含量分別比對(duì)照降低15.26%和34.11%。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.5 和3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片SS 含量，pH 值4.5 和4.0 的模擬酸雨能顯著增加2 種植物葉片SS 含量。

圖3 酸雨脅迫對(duì)紅豆杉屬植物葉片SS、SP 含量的影響Fig.3 Effects of acid rain stress on SS and SP contents in leaves of T.chinensis and T.yunnanensis

隨著pH 值的減小，紅豆杉和云南紅豆杉葉片SP 含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)pH 值為4.5 時(shí)，相比對(duì)照分別上升11.62%和29.05%，后者差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)pH 值為3.0 時(shí)，分別比對(duì)照降低17.01%和48.44%，差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，pH 值3.0 的模擬酸雨能顯著降低2 種植物葉片SP 含量，pH 值4.5 的模擬酸雨可增加2 種植物葉片SP 含量。

2.4 酸雨脅迫下紅豆杉屬植物葉片各生理指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)

如表1、2 所示，不同pH 值模擬酸雨處理對(duì)紅豆杉屬植物的作用效果不同，2 種植物對(duì)pH 值3.0 的重度酸雨耐受性最弱，但對(duì)輕度酸雨有一定的耐受性。其中：紅豆杉對(duì)pH 值4.5 的模擬酸雨耐受性最強(qiáng)，而云南紅豆杉對(duì)pH 值4.0 的模擬酸雨耐受性最強(qiáng)。經(jīng)不同pH 值酸雨脅迫處理后，2 種植物葉片各生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)值綜合排名為：云南紅豆杉第1、紅豆杉第2，表明云南紅豆杉對(duì)模擬酸雨的耐受性比紅豆杉強(qiáng)。

表1 酸雨脅迫下紅豆杉屬植物葉片內(nèi)各生理指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值Table 1 Average physiological indices on membership function of leaves of T.chinensis and T.yunnanensis under acid rain stress

表2 酸雨脅迫對(duì)不同紅豆杉屬植物葉片中生理指標(biāo)的綜合評(píng)價(jià)Table 2 Overall evaluation on physiological indices of leaves of T.chinensis and T.yunnanensis under acid rain stress

3 討論

3.1 模擬酸雨對(duì)紅豆杉屬2 種植物葉片抗氧化酶活性的影響

與抗逆性有關(guān)的APX、PPO、CAT、SOD 和POD等抗氧化活性酶及其共同酶構(gòu)成了抗氧化酶系統(tǒng)，這些抗氧化酶活性的平衡確保了和H2O2等活性氧維持在穩(wěn)定和安全水平[21]。植物體內(nèi)清除活性氧能力的提升需要SOD、POD 和CAT 等相互配合，在酸雨脅迫下，抗氧化酶活性會(huì)隨著脅迫強(qiáng)度和時(shí)間增加發(fā)生變化，當(dāng)出現(xiàn)超過(guò)植物耐受閾值的高強(qiáng)度酸雨時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧就會(huì)超過(guò)抗氧化系統(tǒng)的自?xún)魳O限從而引起氧化損害，最終損傷植物[22]。在本試驗(yàn)中，隨著脅迫強(qiáng)度的增加，2 種植物葉片的APX、PPO、SOD、POD 和CAT 活性整體呈先升高再降低的趨勢(shì)，表明輕度酸雨脅迫激發(fā)了植物自身的抗逆體系，這與趙英[23]、趙棟[22]和孫兵[15]研究紫玉蘭（Magnolia liliflora）、山茶（Camellia japonica）和曼地亞紅豆杉（Taxus media）響應(yīng)模擬酸雨脅迫所得出的結(jié)論相一致。但在不同酸雨脅迫處理和不同物種之間，各項(xiàng)酶活性指標(biāo)有所差異。在pH 值4.5 的模擬酸雨脅迫下，紅豆杉葉片的SOD、POD、CAT、PPO 活性和云南紅豆杉葉片的PPO、APX、SOD活性顯著升高；在pH 值4.0 的模擬酸雨脅迫下，紅豆杉葉片的APX 活性和云南紅豆杉葉片的CAT 活性顯著升高；但在pH 值3.0 的酸雨脅迫下，2 種植物葉片的各項(xiàng)酶活性指標(biāo)均顯著降低，表明紅豆杉和云南紅豆杉分別對(duì)pH 值4.5 和pH 值4.0 的酸雨有一定的抗性，但pH 值3.0 的重度酸雨會(huì)嚴(yán)重影響2 種植物的抗氧化酶活性。

3.2 模擬酸雨對(duì)紅豆杉屬2 種植物葉片MDA、CHL 和CAR 含量的影響

CHL 是植物光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，植物體內(nèi)光合作用能力的高低以及光合產(chǎn)物的多少會(huì)因其含量的高低而不同；CAR 屬于聚光色素，通過(guò)吸收多余光能阻止強(qiáng)光破壞CHL[24]。陶秀花[25]指出：酸雨的酸度越高，植物體內(nèi)的CHL 含量越低。周原也[26]在研究酸雨脅迫對(duì)茶樹(shù)（Camellia sinensis）的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)CHL 和CAR 含量會(huì)隨著酸雨脅迫的增強(qiáng)不斷減少。MDA 含量水平的高低代表了植物葉片細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度和對(duì)逆境反應(yīng)的強(qiáng)弱[22]。郭慧媛[27]和張銀[14]揭示了“隨著酸雨脅迫強(qiáng)度的增加，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)過(guò)度消耗，致使MDA 含量不斷提升”的規(guī)律。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，在pH 值4.5 的模擬酸雨脅迫下，紅豆杉葉片CHL 含量和云南紅豆杉葉片CAR 含量有不同程度的增加，表明2 種植物對(duì)輕度酸雨有一定的耐受性；但在pH 值3.0 的重度酸雨脅迫下，2 種植物葉片的MDA 含量顯著升高，CHL 和CAR 含量顯著降低，表明2 種植物均不耐受重度酸雨。

3.3 模擬酸雨對(duì)紅豆杉屬2 種植物葉片有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

逆境會(huì)造成植物體內(nèi)水分缺失，為了維持體內(nèi)水分滲透平衡，植物會(huì)通過(guò)積累SS 和SP 等有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，來(lái)緩解逆境脅迫給自身帶來(lái)的傷害[28]。在本試驗(yàn)中，隨著酸雨脅迫的增強(qiáng)，紅豆杉和云南紅豆杉葉片的SS 和SP 含量整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與馬蘭[28]研究不同類(lèi)型酸脅迫對(duì)云杉（Picea asperata）和多花黑麥草（Lolium multiflorum）抗性生理的影響時(shí)所得出的結(jié)論一致。也與廖源林[29]有關(guān)苦楝（Melia azedarachL）的研究結(jié)論相一致。但在不同酸雨脅迫處理及不同物種之間，SS 和SP 含量有所差異。在pH 值4.0～4.5 模擬酸雨脅迫下，2 種植物葉片SS 含量顯著增加，在pH 值4.5 模擬酸雨脅迫下，2 種植物葉片SP 含量顯著增加，表明2 種植物對(duì)輕度酸雨有一定的抗性；但在pH 值3.0 的重度酸雨脅迫下，SS 和SP 含量均降至最低（P＜0.05），表明隨著酸雨脅迫的加重，對(duì)2 種植物的損傷越大。

4 結(jié)論

不同pH 值酸雨脅迫下，云南紅豆杉對(duì)模擬酸雨的耐受性比紅豆杉強(qiáng)；供試的2 種植物對(duì)輕度酸雨均有一定的耐受性，其中，紅豆杉對(duì)pH 值4.5 的模擬酸雨耐受性最好，云南紅豆杉對(duì)pH 值4.0 的模擬酸雨耐受性最好，但均不耐受pH 值3.0 的重度酸雨。