蔣小剛，王 華，郭坤元，張美德

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所/國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系恩施綜合試驗站/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心中藥材分中心，湖北 恩施 445000）

0 引言

【研究意義】湖北貝母（Fritillaria hupehensisHsiao et K.C.Hsia）屬于百合科貝母屬多年生草本植物，主要分布于湖北西南部，在恩施、建始、五峰等地有大面積種植，距今已有200 多年的栽培歷史，是湖北省道地藥材之一[1-2]。湖北貝母鱗莖中含有活性成分生物堿，牛換云等[3]通過體外抑菌試驗發(fā)現(xiàn)湖北貝母總生物堿及單體生物堿對革蘭氏陽性菌的抑菌作用強于革蘭氏陰性菌，表明湖北貝母總生物堿以及單體生物堿均有一定的抑菌活性；張勇慧等[4]以小鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)湖北貝母生物堿單體比如鄂貝甲素、湖貝甲素苷具有鎮(zhèn)咳祛痰的功效。隨著研究的不斷深入，湖北貝母的藥用價值逐漸得到了人們的認(rèn)可，《中華人民共和國藥典》最新幾版均收載了湖北貝母，使其成為國家法定中藥材[5]。湖北貝母以干燥鱗莖入藥，具有清肺化痰、止咳、散結(jié)的功能，主要用于治療熱痰咳嗽，痰核瘰疬，癰腫瘡毒等癥狀[6-7]。近年來，中藥材產(chǎn)業(yè)正處于蓬勃發(fā)展階段，巨大利益驅(qū)動下湖北貝母等藥材市場出現(xiàn)品種混雜、質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象。因此，構(gòu)建高效快捷的鑒別體系對于湖北貝母的鑒定及資源保護(hù)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】ISSR 分子標(biāo)記是一種基于微衛(wèi)星序列開發(fā)的新型分子標(biāo)記技術(shù)，該方法操作簡單，尤其適用于檢測基因組序列未知的物種的多樣性[8-9]。余志雄等[10]采用單因素試驗結(jié)合正交設(shè)計的方法，建立了火龍果ISSR-PCR優(yōu)化體系，并發(fā)現(xiàn)相比于DNA 模板含量，dNTP、引物和TaqDNA 聚合酶含量對ISSR-PCR 反應(yīng)影響更大；采用上述建立的優(yōu)化體系，袁亞芳等[11]對福建地區(qū)20 份火龍果種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，初步揭示了不同地區(qū)種質(zhì)親緣關(guān)系，為火龍果種質(zhì)鑒定和品種選育提供價值；張立杰等[12]采用正交設(shè)計的方法優(yōu)化蓮霧ISSR-PCR 反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)引物濃度是影響PCR 的最重要因素，建立的優(yōu)化體系將為蓮霧種質(zhì)資源評價、優(yōu)良品種選育等提供科學(xué)依據(jù)。何橋等[13]用建立的優(yōu)化體系將14 份蓮霧種質(zhì)聚類為4 組，與按照果實成熟期的劃分結(jié)果基本一致。此外，在白術(shù)[14]、淫羊藿[15]、獼猴桃[16]等藥用植物也開展了ISSR-PCR 優(yōu)化體系的研究，這些研究將為藥用植物的種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系、遺傳多樣性分析、良種選育等提供科學(xué)依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c】目前在湖北貝母的研究多集中于生態(tài)種植、病蟲害防治、藥理藥效等方面[7,17]，湖北貝母遺傳多樣性分析的研究有待深入探討，因此亟需進(jìn)行湖北貝母的遺傳多樣性分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬采用均勻設(shè)計和單因素試驗結(jié)合的方法，進(jìn)行湖北貝母ISSR-PCR 體系優(yōu)化、多態(tài)性引物篩選及遺傳多樣性分析，為湖北貝母種質(zhì)鑒定及品種選育奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料采集于恩施市新塘鄉(xiāng)湖北貝母資源圃，包括湖北恩施市、利川市、建始縣等產(chǎn)地的12 份湖北貝母葉片樣品，產(chǎn)地信息見表1，隨機選取每個產(chǎn)地3 株植株的幼嫩葉片作為一份樣品，裝入自封袋中，回實驗室后，保存于-20 ℃冰箱備用。

表1 12 份湖北貝母種質(zhì)資源產(chǎn)地Table 1 Producing areas of 12 F.hupehensis germplasms

1.2 試劑與儀器

供試的ISSR 引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）設(shè)計的100 條引物序列，由上海英俊生物技術(shù)公司合成，核酸染料Gel-red 以及2×TaqMaster Mix均購自武漢中恩科技有限公司。主要儀器設(shè)備：離心機（SIGMA 3K15）、電泳儀（DYCP-31DN）、超微量核酸測定儀（Thermo NANODROP ONE）、PCR 儀（DYY-12）。

1.3 基因組DNA 提取與檢測

采用北京天根生物科技有限公司的新型植物DNA提取試劑盒，提取12 份湖北貝母葉片基因組DNA，通過分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳對DNA 的濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.4 ISSR-PCR 體系均勻設(shè)計

均勻設(shè)計原理是基于數(shù)論中的一致分布理論，將數(shù)論和多元統(tǒng)計相結(jié)合，充分考慮試驗點在試驗范圍內(nèi)的“均衡分散”性，使試驗點均勻分布[18]。本研究采用3 因素4 水平的U12（43）均勻設(shè)計表設(shè)計PCR體系各因素水平（表2、表3），以引物UBC873 為例，DNA 模板濃度為50 ng·μL-1，引物濃度為2.5 μmol·L-1，通過12 個20 μL 反應(yīng)體系，篩序較優(yōu)ISSR-PCR 體系。PCR 程序：（1）94 ℃，預(yù)變性5 min；（2）94 ℃，變性0.75 min，52 ℃，復(fù)性0.75 min，延伸1.5 min，共40 個循環(huán)；（3）最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

表3 ISSR-PCR 均勻設(shè)計U12（43）Table 3 Mixed uniform design U12（43）for ISSR-PCR （單位:μL）

1.5 ISSR-PCR 體系單因素試驗

基于U12（43）均勻設(shè)計試驗確定的較優(yōu)ISSRPCR 體系，進(jìn)行2×TaqMaster mix（表4）、模板DNA（表5）、引物（表6）的單因素試驗，反應(yīng)體系20 uL，PCR 程序同 ISSR-PCR 體系均勻設(shè)計。

表4 2×Taq Master mix 的單因素試驗設(shè)計Table 4 Single factor screening test on 2×Taq Master Mix （單位:μL）

表5 模板DNA 的單因素試驗設(shè)計Table 5 Single factor screening test on DNA （單位:μL）

1.6 最佳退火溫度確定

基于優(yōu)化的ISSR-PCR 體系篩選ISSR 引物的最佳退火溫度，基于引物TM 值設(shè)置8 個退火溫度，PCR 程序其他條件同上。

1.7 最優(yōu)反應(yīng)體系驗證

基于優(yōu)化的ISSR-PCR 體系，用引物UBC866 對12 份不同產(chǎn)地的湖北貝母資源進(jìn)行優(yōu)化體系驗證，優(yōu)化體系（20 μL）：DNA 模板0.8 uL（40.0 ng），2×TaqMaster mix 10.5 μL，引 物2.2 μL（5.5 μmol），ddH2O 6.5 μL。PCR 程序：（1）94 ℃，預(yù)變性5 min；（2）94 ℃，變性0.75 min，60.0 ℃，退火0.75 min，延伸1.5 min，共40 個循環(huán)；（3）最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 提取及檢測

由圖1 可知，提取的12 份湖北貝母基因組DNA條帶清晰，無拖尾，中藥材條形碼ITS2引物都擴增出500 bp 左右的片段，條帶清晰明亮（圖2），表明提取的湖北貝母基因組DNA 質(zhì)量高，可用于后續(xù)ISSR-PCR 體系建立與優(yōu)化。

圖1 12 份湖北貝母基因組DNA 電泳圖Fig.1 DNA electrophoretograms of 12 F.hupehensis germplasms

圖2 12 份湖北貝母ITS2 擴增結(jié)果Fig.2 ITS2 amplifications on 12 F.hupehensis germplasms

2.2 均勻設(shè)計優(yōu)化ISSR-PCR體系

以湖北貝母基因組DNA 為模板，UBC873 為擴增引物，采用均勻設(shè)計U12（43）方法建立ISSRPCR 體系，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)（表3）。圖3 結(jié)果表明，除處理4、5、12 外，其他處理各重復(fù)都擴增出5 個條帶，而處理6 擴增條帶最亮，重復(fù)性好，且2×TaqMaster mix 用量較少，綜合考量條帶數(shù)量、亮度、2×TaqMaster mix 用量、重復(fù)性等因素，選擇處理6 作為ISSR-PCR 初步較優(yōu)體系。

圖3 ISSR-PCR 均勻設(shè)計U12（43）擴增結(jié)果Fig.3 Results of U12(43) uniform design experiment for ISSR-PCR

2.3 單因素試驗優(yōu)化ISSR-PCR 體系

2.3.1 2×TaqMaster mix 的單因素試驗 在均勻設(shè)計處理6 的基礎(chǔ)上進(jìn)行2×TaqMaster mix 的單因素試驗（表4），每個處理3 個重復(fù)。由圖4 可知，各處理的3 個重復(fù)都能擴增出5 條帶，而處理4 的3 個重復(fù)整體的條帶亮度和清晰度都最高，因此10.5 uL 為2×TaqMaster mix 的單因素試驗的最佳用量。

圖4 2×Taq Master mix 單因素試驗設(shè)計的ISSR-PCRFig.4 ISSR-PCR of single factor screening test on 2×Taq Master Mix

2.3.2 模板DNA 的單因素試驗 在2×TaqMaster mix的單因素試驗的處理4 基礎(chǔ)上，進(jìn)行模板DNA 的單因素試驗（表5），由圖5 可知，各處理都能擴增出5 條清晰條帶，處理3、4、5、6 條帶亮度基本一致，考慮DNA 用量的經(jīng)濟(jì)適用性，處理3 為最優(yōu)處理，即0.8 μL（40.0 ng）為模板DNA 的單因素試驗的最佳用量。

圖5 模板DNA 的單因素試驗設(shè)計的ISSR-PCRFig.5 ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

2.3.3 引物的單因素試驗 在模板DNA 的單因素試驗處理3 的基礎(chǔ)上，進(jìn)行引物的單因素試驗設(shè)計（表6），由圖6 可知，處理5 整體條帶亮度和清晰度都高于其他各處理，表明2.2 μL 為引物單因素試驗最佳用量。

圖6 引物的單因素試驗設(shè)計的ISSR-PCRFig.6 ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

表6 引物的單因素試驗設(shè)計Table 6 Single factor screening test on primers （單位：μL）

2.4 最佳退火溫度的確定

基于優(yōu)化的ISSR-PCR 體系通過梯度退火溫度試驗確定引物的最佳退火溫度，以引物UBC848 為例（圖7），退火溫度為59.3 ℃時，引物UBC848 擴增的條帶數(shù)最多，且條帶最明亮清晰，退火溫度過高或過低時，條帶數(shù)和清晰度明顯降低，表明引物UBC848 的最佳退火溫度為59.3 ℃，其余引物的最佳退火溫度見表7。

圖7 引物UBC848 不同退火溫度擴增Fig.7 Amplification of primer UBC848 at different annealing temperatures

2.5 優(yōu)化體系驗證

優(yōu)化的ISSR-PCR 體系（20 μL）：2×TaqMaster mix 10.5 μL，模板DNA 0.8 μL（40.0 ng），引物2.2 uL（5.5 μmol），ddH2O 6.5 μL。用表7 篩選的多態(tài)性引物對表1 的12 份湖北貝母資源進(jìn)行優(yōu)化體系驗證。圖8 為引物 UBC866 的擴增結(jié)果，可見擴增條帶清晰，多態(tài)性豐富，表明優(yōu)化的ISSR-PCR 體系穩(wěn)定可靠，可用于湖北貝母ISSR 分析。

圖8 引物 UBC866 對12 份湖北貝母資源的擴增結(jié)果Fig.8 Amplification results of 12 F.hupehensis germplasms by primer UBC866

表7 ISSR 引物最佳退火溫度Table 7 Optimum primer annealing temperature

2.6 遺傳多樣性分析結(jié)果

采用NTSYS-pc2.1 分析12 份湖北貝母種質(zhì)遺傳相似系數(shù)。如表8 所示，各種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)范圍為0.542 9～0.942 9，其中FH3 和FH5，F(xiàn)H1 和FH12的遺傳相似系數(shù)最大，都為0.942 9，表明FH3 和FH5，F(xiàn)H1 和FH12 的親緣關(guān)系最近；其中FH8 和FH11 的遺傳相似系數(shù)最小，為0.542 9，表明FH8 和FH11 的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。采用UPGMA 聚類法對供試材料進(jìn)行聚類分析，由圖9 知，遺傳相似系數(shù)為0.75 時，可將12 份湖北貝母種質(zhì)聚為3 類，第一類包括FH1、FH2、FH3、FH5、FH6、FH7、FH11、FH12，第二類包括FH4、FH8、FH9，第三類包括FH10。

圖9 12 份湖北貝母種質(zhì)聚類分析Fig.9 Cluster diagram of 12 F.hupehensis germplasms

表8 12 份湖北貝母遺傳相似系數(shù)Table 8 Genetic similarity coefficients of 12 F.hupehensis germplasms

3 討論與結(jié)論

ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物、微生物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析等研究中，相比傳統(tǒng)分子標(biāo)記，ISSR 分子標(biāo)記具有數(shù)量多、易檢測、成本低的優(yōu)勢[16]。ISSR-PCR 反應(yīng)易受酶、DNA模板、引物等因素的綜合影響，因此需要對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。目前，很多研究采用正交設(shè)計和單因素試驗的方法優(yōu)化ISSR-PCR 體系[19]，而本研究采用的是均勻設(shè)計結(jié)合單因素試驗，在原理上，均勻設(shè)計與正交設(shè)計相似，能均衡考慮各因素的影響，簡化試驗程序和步驟[14,18]，但相比于多數(shù)研究采用的L16（45）正交試驗設(shè)計[19-20]，本研究采用的U12（43）均勻設(shè)計在保證實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，能減少工作量和節(jié)省時間。

DNA 模板、Taq酶、Mg2+、dNTP 等是PCR 擴增反應(yīng)的重要因素，本研究中，用2×TaqMaster mix代替了Taq酶、Mg2+、dNTP、緩沖液。單因素試驗結(jié)果表明，DNA 模板及引物用量對反應(yīng)結(jié)果影響最大，DNA 模板和引物含量過低會降低反應(yīng)效率，過高導(dǎo)致非特異性擴增，這與丁雯等[20]研究結(jié)果一致。2×TaqMaster mix用量也是較為重要的影響因素，隨著2×TaqMaster mix 用量增加，條帶亮度緩慢升高，繼續(xù)增加至一定量時，條帶亮度降低，這與郭傲等[21]研究結(jié)果較為一致，表明2×TaqMaster mix 濃度過低時，合成產(chǎn)物較少，濃度過高時，會導(dǎo)致非特異性擴增，條帶清晰度降低。

研究表明引物的退火溫度高低對擴增結(jié)果影響較大。退火溫度過高，引物與模板不易結(jié)合，導(dǎo)致擴增效率降低；退火溫度過低，引物與模板易錯配結(jié)合，出現(xiàn)非特異性擴增，表現(xiàn)拖尾現(xiàn)象[22]。本研究基于優(yōu)化的ISSR-PCR 體系通過梯度退火試驗篩選引物的最佳退火溫度，結(jié)果表明，篩選的大部分引物最佳退火溫度值整體較高，在一定范圍內(nèi)隨著退火溫度的升高，條帶數(shù)和清晰度逐漸增加，而當(dāng)退火溫度升高至一定值后，條帶數(shù)和清晰度減小，這與閆林等[23]研究結(jié)果較為一致，表明篩選的引物基本都能適應(yīng)較高的退火溫度?；趦?yōu)化的ISSRPCR 體系，通過梯度退火溫度試驗篩選引物的最佳退火溫度，用篩選后的引物U866 對12 份湖北貝母資源進(jìn)行ISSR-PCR 優(yōu)化體系驗證，結(jié)果表明，優(yōu)化體系擴增的條帶清晰穩(wěn)定，多態(tài)性較好，適用于遺傳多樣性分析。

聚類分析可將供試種質(zhì)聚為3 類，表明篩選的多態(tài)性ISSR 引物適用于區(qū)分不同種質(zhì)遺傳差異，供試種質(zhì)親緣關(guān)系無地域性差異，這與浙貝母、新疆貝母的遺傳多樣性研究結(jié)果存在差異[24-25]，此類差異形成原因可能與不同貝母屬種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性、采樣地點、采樣數(shù)量等有關(guān)。本研究結(jié)果將為湖北貝母種質(zhì)鑒定及良種選育提供參考依據(jù)。