蘇岳峰，丁元昊，郝朝運(yùn)，胡麗松，鄭其向,3，范 睿

（1.海南大學(xué)，海南 ?？?570208；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬寧 571533；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南 普洱 665000）

0 引言

【研究意義】胡椒（Piper nigrumL.）被稱為“香料之王”，是胡椒科胡椒屬植物，主產(chǎn)我國(guó)海南、云南和廣東等地區(qū)。胡椒瘟病是由辣椒疫霉菌侵染胡椒的根系、葉片、花序、果穗、果實(shí)等部位而發(fā)病，具有氣候依賴性且傳染力極強(qiáng)的特點(diǎn)[1]；病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致全園毀滅，嚴(yán)重阻礙胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展，缺乏抗瘟病種質(zhì)是影響我國(guó)胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要問題[2]。因此，篩選胡椒關(guān)鍵基因進(jìn)行功能驗(yàn)證對(duì)植物材料的遺傳改良尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】次生代謝是植物生長(zhǎng)發(fā)育以及適應(yīng)環(huán)境的重要環(huán)節(jié)。苯丙烷途徑是響應(yīng)多種逆境的關(guān)鍵途徑，如：紫外線損傷、病原侵染、機(jī)械損傷、低溫脅迫等。苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和入口酶[3]。玉米的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）抵抗甘蔗花葉病毒，與木質(zhì)素和水楊酸合成有關(guān)，陸地棉和馬鈴薯等中也有PAL 抵抗病菌侵染的報(bào)道[3-4]。此外苯丙氨酸解氨酶還是合成花青素和類黃酮等重要的脅迫響應(yīng)次生代謝物質(zhì)的必要酶[5]。目前，PAL的生物信息學(xué)分析已在水稻、棉花、桑樹等作物中開展，分析結(jié)果顯示PAL基因響應(yīng)生物和非生物脅迫反應(yīng)[6-8]。PAL在單雙子葉植物分化之前已完成分化，通常是一個(gè)多基因家族，含有5 個(gè)左右家族成員[9]。PAL家族在不同作物中保守域不同，主要包括：苯丙氨酸保守結(jié)構(gòu)域、PLN02457 和PLN02457 super family、PAL-HAL、phe-am-lyase 和Lyase aromatic 保守結(jié)構(gòu)域、裂解酶I 類超家族保守結(jié)構(gòu)域等[10-11]。然而，各物種所含保守域不同可能行使不同的生理功能，當(dāng)歸中PAL 催化類似的β 消除反應(yīng)，與具有裂解酶I 類超家族保守結(jié)構(gòu)域有關(guān)[12]。在柱花草中，PAL-HAL 是保守的脫氨位點(diǎn)[11]。目前，胡椒瘟病防控多以預(yù)防為主，防控成本極高。在分子生物學(xué)方面對(duì)胡椒瘟病的研究也僅限于栽培種與野生近緣種的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究和抗瘟病基因挖掘[13]。項(xiàng)目組前期的轉(zhuǎn)錄學(xué)結(jié)果顯示胡椒抗/感種質(zhì)（熱引1 號(hào)、黃花胡椒）差異基因多富集于苯丙烷代謝途徑，且組織化學(xué)顯示苯丙氨酸解氨酶活性在抗性種質(zhì)中較高[13]。本研究首次開展胡椒PnPAL基因研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷途徑的入口酶及限速酶，在植物與病原菌互作過程中具有重要意義。因此，研究胡椒PnPAL的家族特征、進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)模式，能夠?yàn)檫M(jìn)一步確定胡椒PnPAL基因在抗瘟病中的功能奠定基礎(chǔ)。【擬解決的關(guān)鍵問題】采用在線分析工具及TB tools 工具，胡椒PnPAL的順式作用元件、motif、外顯子和內(nèi)含子位置、保守結(jié)構(gòu)域，親緣關(guān)系及接種病原菌下PnPAL基因的表達(dá)模式，有利于了解胡椒PnPAL的基因功能，便于胡椒新品種選育。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

我國(guó)主栽胡椒品種熱引1 號(hào)（Piper nigrumL.）全基因組數(shù)據(jù)來自美國(guó)生物信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA529758。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PnPAL基因家族成員鑒定 根據(jù)胡椒基因組注釋文件信息，鑒定到胡椒PnPAL基因家族成員和胡椒PnPAL的蛋白序列及染色體定位信息，再利用在線預(yù)測(cè)蛋白信息工具Expasy（https://www.expasy.org/）分析各個(gè)PnPAL的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸個(gè)數(shù)，運(yùn)用BUSCA 在線分析工具預(yù)測(cè)各PnPAL亞細(xì)胞定位（http://busca.biocomp.unibo.it/59a16590-35 06-4818-8017-7032b057b649/showresult/）。

1.2.2PnPAL基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析 根據(jù)基因組注釋信息中的外顯子和內(nèi)含子長(zhǎng)度分布信息，結(jié)合基因結(jié)構(gòu)顯示在線分析工具（GSDS）繪制胡椒PnPAL外顯子、內(nèi)含子位置示意圖。利用Mega 5.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）的鄰接法構(gòu)建胡椒各PnPAL的親緣關(guān)系。

1.2.3 胡椒PnPAL保守基序分析 運(yùn)用motif 基礎(chǔ)上的序列分析工具（MEME）預(yù)測(cè)蛋白序列保守基序（http://meme-suite.org/）和美國(guó)生物信息技術(shù)中心的CDD 工具分析所得domain和TB tools 繪制成圖（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）。

1.2.4 胡椒PnPAL啟動(dòng)子分析 利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)Plant CARE 和TB tools 分析胡椒PnPAL起始密碼子上游2 000 bp 的順式作用元件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。

1.2.5 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 運(yùn)用美國(guó)生物信息中心的Blast 工具，獲得注釋信息為苯丙氨酸解氨酶的蛋白序列，并結(jié)合擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacumL.）、小麥（Triticum aestivumL.）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、大麥（Hordeum vulgareL.）、菠蘿（Ananas comosus）、香蕉（Musa nana Lour.）、橡膠（Hevea brasiliensis）、棉花（Gossypium arboreum）、油菜（Brassica napusL.）、鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）、牛樟（Cinnamomum micranthumf.kanehirae）、鱷梨（Persea americana）、睡蓮（Nymphaea colorata）、無油樟（Amborella trichopoda）等作物的蛋白序列，采用Mega5.0 的鄰接法分析物種間苯丙氨酸解氨酶的親緣關(guān)系。數(shù)據(jù)來源于美國(guó)生物信息中心NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），擬南芥信息網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/index.jsp），國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（http://www.ricedata.cn/）。

1.2.6 針刺法接種病原菌 在扦插苗靠近土層的地上部用無菌注射器刺3 個(gè)小洞，呈三角形，用打孔器取一塊直徑為1 cm 的菌絲快，將有菌絲的一面覆在刺破的洞上，用浸濕的棉花纏繞固定菌塊，起到保濕和固定的作用。

1.2.7PnPAL表達(dá)模式分析 使用Prime primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物見表1。針刺法在胡椒莖基部接種辣椒疫霉菌（參照1.2.6），以接種病原菌后0、8、12、24、48 h 的胡椒根系為材料，運(yùn)用Real Time PCR 的方法分析7 條含有完整保守序列的PnPAL表達(dá)模式。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析所用引物Table 1 Primers used in RT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 胡椒PnPAL 全基因組鑒定

如表2 所示，根據(jù)基因組注釋信息，共鑒定到14 條胡椒苯丙氨酸解氨酶PnPAL基因，不均勻分布在9 條染色體上，其中有4 條位于2 號(hào)染色體上，3 條位于6 號(hào)染色體上，3 號(hào)、5 號(hào)、8 號(hào)、9 號(hào)、18 號(hào)、28 號(hào)和38 號(hào)染色體上各含有1 條。理化性質(zhì)分析表明，PnPAL所含氨基酸殘基數(shù)目在72～736，其中PnPAL14 含有的氨基酸殘基數(shù)目最多，PnPAL8含有的氨基酸殘基數(shù)目最少，所編碼氨基酸殘基數(shù)量均值為500 個(gè)。各個(gè)PAL 蛋白質(zhì)分子量在7.374 41～83.431 07 kDa，蛋白質(zhì)平均分子量為50.933 kDa。胡椒PnPAL編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)在5.76～9.77，平均等電點(diǎn)為7.18，其中PnPAL1、2、3、4、10、13、14 為酸性蛋白（理論等電點(diǎn)pI＜7），PnPAL5、6、7、8、9、11、12 為堿性蛋白（理論等電點(diǎn)pI＞7）。亞細(xì)胞分析表明，PnPAL1、2、3、4、10 位于細(xì)胞質(zhì)中，PnPAL5、7、8、9 位于細(xì)胞核中，PnPAL6、11 位于葉綠體中，PnPAL12 位于內(nèi)膜系統(tǒng)中，PnPAL13、14 位于質(zhì)膜中。

表2 胡椒PnPAL 基因家族成員的理化性質(zhì)Table 2 Physiochemical properties of PnPAL family in black peppers

2.2 胡椒PnPAL 基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析

如圖1 所示，運(yùn)用mega 對(duì)鑒定到的14 條PnPAL聚類分析表明，PnPAL4、10、3、13、14、1、2、5、7 聚為一類，PnPAL11、12 聚為一類，PnPAL6、8 聚為一類，表明胡椒PnPAL家族可分為3 個(gè)進(jìn)化單元。運(yùn)用GSDS 分析基因結(jié)構(gòu)結(jié)果表明，家族成員外顯子個(gè)數(shù)在1～5 個(gè)，內(nèi)含子個(gè)數(shù)在1～4 個(gè)，其中PnPAL2、7、8、12、13 沒有內(nèi)含子，PnPAL3、4、5、10、14 含有兩個(gè)外顯子，PnPAL1 含有3 個(gè)外顯子，PnPAL6 含有4 個(gè)外顯子，PnPAL11 含有5 個(gè)外顯子，平均外顯子個(gè)數(shù)約為2 個(gè)。

圖1 胡椒PnPAL 基因家族基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Structure of PnPAL family in black peppers

2.3 胡椒PnPAL 保守基序分析

如圖2 所示，在線分析工具M(jìn)EME 鑒定到8 個(gè)保守基序，命名為Motif1～Motif8。在14 條胡椒PnPAL中，每條家族成員所包含motif 0～8 個(gè)不等，其中7 條PnPAL所含motif 個(gè)數(shù)最多，含有完整的8 個(gè)motif，3 條不含有motif，1 條含有5 個(gè)motif，1 條含有3 個(gè)motif。

圖2 胡椒PnPAL motif 分析Fig.2 PnPAL motifs of black peppers

如圖3 所示，NCBI CDD 結(jié)果表明，7 條含有PLN02457 結(jié)合位點(diǎn)，4 條PnPAL屬于PLN02457 超家族，1 條含有保守結(jié)構(gòu)域NEMP，1 條屬于FNRlike 超家族，1 條屬于bHLH-MYC-N 超家族。

圖3 胡椒PnPAL domain 分析Fig.3 PnPAL domain of black peppers

綜上，7 條含有完整motif 的家族成員均含有PLN02457 結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)此7 條家族成員為胡椒PnPAL家族成員。

2.4 胡椒PnPAL 啟動(dòng)子分析

如圖4 所示，胡椒PnPAL基因家族成員除基本的順勢(shì)作用元件之外，還包括多個(gè)與激素和脅迫有關(guān)的順式作用元件，包括低溫響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激相關(guān)元件、光反應(yīng)元件以及水楊酸、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件等，其中含有脫落酸響應(yīng)元件的PnPAL最多，達(dá)13 條，含有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件的PnPAL次之，有11 條，8 條含有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件，5 條含有赤霉素響應(yīng)元件，5 條含有防御和脅迫相關(guān)的元件，4 條含有水楊酸響應(yīng)元件，4 條含有低溫響應(yīng)元件，1 條含有機(jī)械損傷響應(yīng)元件，表明PnPAL參與生物和非生物脅迫響應(yīng)，在植物防御和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面至關(guān)重要。PnPAL1所含順式作用元件最多，達(dá)36 個(gè)；PnPAL8所含順式作用元件最少，僅為17 個(gè)，平均順式作用元件個(gè)數(shù)約為23 個(gè)，表明PnPAL響應(yīng)多項(xiàng)逆境，其中PnPAL1含有啟動(dòng)子元件明顯多于其他家族成員，PnPAL1可能響應(yīng)多項(xiàng)逆境。

圖4 胡椒PnPAL 啟動(dòng)子分析Fig.4 PnPAL promoter of black peppers

2.5 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

苯丙烷途徑是在裸子植物向被子植物進(jìn)化過程中形成的，如圖5 所示，本研究將具有完整結(jié)構(gòu)的7個(gè)胡椒PnPAL基因與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacumL.）、小麥（Triticum aestivumL.）、玉米（Zea mays）、水稻（Oryza sativa）、高粱（Sorghum bicolor）、大麥（Hordeum vulgareL.）、菠蘿（Ananas comosus）、香蕉（Musa nana Lour.）、橡膠（Hevea brasiliensis）、棉花（Gossypium arboreum）、油菜（Brassica napusL.）、鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）、牛樟（Cinnamomum micranthumf.kanehirae）、鱷梨（Persea americana）、睡蓮（Nymphaea colorata）、無油樟（Amborella trichopoda）等植物的PAL基因進(jìn)行進(jìn)化分析，這些基因主要分為單子葉與雙子葉兩類。然而，胡椒的PnPAL基因均處于雙子葉植物的位置，且與木蘭類的植物親緣關(guān)系較為接近。此外，PnPAL1，PnPAL2，PnPAL13，PnPAL14 位于系統(tǒng)發(fā)生樹的基部，表明這4 個(gè)基因?qū)儆谳^原始的類型；另一方面，PnPAL3，PnPAL4，PnPAL10 位于離系統(tǒng)發(fā)生樹基部較近的位置，且與木蘭類的植物聚在一起?，F(xiàn)代植物學(xué)家普遍承認(rèn)“真花學(xué)說”，認(rèn)為木蘭類的植物屬于較原始的類群，因此，胡椒的PnPAL基因較為古老，與胡椒的系統(tǒng)地位相似[14-15]。

圖5 胡椒PnPAL 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 胡椒PnPAL 表達(dá)模式分析

對(duì)篩選到完整的7 條PnPAL進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果表明PnPAL3、PnPAL10 有表達(dá)，其余5 條未檢測(cè)到信號(hào)。其中PnPAL3 和PnPAL10 在接種后0、8、12、24、48 h 的根系中均有表達(dá)。如圖6 所示，PnPAL3 在接種病原菌初期表達(dá)相對(duì)較高，這可能與植物的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。如圖7 所示，PnPAL10表達(dá)在處理組中基本呈上調(diào)趨勢(shì)，特別是在接種病原菌后的24、48 h 顯著高于對(duì)照組基因的相對(duì)表達(dá)，表明該基因可能在病原菌侵染胡椒根系過程中起主要作用。

圖6 胡椒PnPAL3 基因相對(duì)表達(dá)分析Fig.6 Relative expressions of PnPAL3 in black peppers

圖7 胡椒PnPAL10 基因相對(duì)表達(dá)分析Fig.7 Analysis on relative expressions of PnPAL10 in black pepper

3 討論

基因組測(cè)序技術(shù)的不斷深入以及功能基因組學(xué)的日漸成熟為基因鑒定提供了便利條件，生物信息學(xué)的地位也日益重要。苯丙氨酸解氨酶基因家族應(yīng)對(duì)各項(xiàng)生物和非生物脅迫，目前，葉小真等在桉樹中克隆獲得了PAL基因序列并分析其表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)該基因在高抗抗焦枯病菌品種中表達(dá)最高[16]；吳遠(yuǎn)航等克隆了木薯的MePAL基因，并發(fā)現(xiàn)該基因可受低溫脅迫誘導(dǎo)增強(qiáng)表達(dá)[17]；高紅勝等克隆了黃瓜的CsPAL基因，發(fā)現(xiàn)其在受白粉菌誘導(dǎo)后顯著高于對(duì)照[18]。本研究在胡椒中鑒定到14 條PnPAL，其中7 條為完整結(jié)構(gòu)，略多于擬南芥、水稻等家族，可能與胡椒基因組復(fù)制有關(guān)[19-20]。植物在進(jìn)化過程中一般都比較保守，保守序列可能調(diào)控基因表達(dá)且含有相同保守序列的基因行使相同功能，甚至一些屬于相同超家族的蛋白功能也相同[21]。筆者發(fā)現(xiàn)7 條胡椒PnPAL均含有保守的基序，推測(cè)它們可能行使相同功能。

由一個(gè)祖先通過基因復(fù)制或突變?yōu)檫m應(yīng)不同環(huán)境而產(chǎn)生一個(gè)基因家族[22]。在植物進(jìn)化過程中，某個(gè)祖先的倍增和變異可以產(chǎn)生多個(gè)家族成員，這些家族成員可能成簇的分布在一條染色體上，也可能分布在不同染色體上[23]。胡椒的PnPAL家族成員在染色體上不均勻分布，可能與基因組復(fù)制及染色體重復(fù)有關(guān)，基因組和染色體重復(fù)對(duì)物種進(jìn)化有重要意義[24]。內(nèi)含子的非法交換和變異可能是基因家族形成的原因[25]，如植物12-氧-植物二烯酸還原酶（12-oxo-phytodienoic acid reductase，OPR）家族基因各內(nèi)含子的位置和長(zhǎng)度存在較大差異，故胡椒PnPAL成員之間基因結(jié)構(gòu)的差異較大[26]。

苯丙氨酸解氨酶普遍存在于植物體中，鑒定到的胡椒PAL 蛋白理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、酸堿性、分子量、編碼長(zhǎng)度等不同，表明胡椒PnPAL有較高的遺傳多樣性。伴隨著物種進(jìn)化能力逐漸增強(qiáng)，環(huán)境適應(yīng)能力愈強(qiáng)，均是遺傳變異豐富造成的，故遺傳變異是導(dǎo)致遺傳多樣性的根本原因[27]。近年來，越來越多研究表明基因表達(dá)調(diào)控對(duì)基因表達(dá)差異起重要作用[28]。在胡椒PnPAL中，各家族成員之間啟動(dòng)子略有差異，每個(gè)PnPAL在不同的生物或非生物脅迫中起作用；家族成員之間啟動(dòng)子的差異可能是進(jìn)化過程中遺傳變異導(dǎo)致的；由于各個(gè)家族成員所含啟動(dòng)子不同，啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控又有一定差異，進(jìn)而表現(xiàn)出PnPAL家族成員參與應(yīng)對(duì)不同的生物和非生物脅迫環(huán)境。

胡椒苯丙氨酸解氨酶家族各基因功能還尚不清晰。本文首次運(yùn)用胡椒基因組信息，鑒定到胡椒的PnPAL家族成員，結(jié)合生物信息學(xué)方法分析胡椒PnPAL基因家族的結(jié)構(gòu)差異，進(jìn)化關(guān)系及表達(dá)模式并篩選到抵抗病原菌的關(guān)鍵家族成員，為進(jìn)一步驗(yàn)證胡椒PnPAL基因功能及響應(yīng)各項(xiàng)逆境研究提供基礎(chǔ)。