呂 炫，賈北平，祝 萌，于勝祖，張 淼，王 蓓，朱英奇，張云凱，王 晴，王桂軍*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，合肥 230036； 2. 安徽省皖西白鵝原種場有限公司，六安 237158)

近年來，隨著我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，各種動物疾病有著不斷增多的趨勢，如病毒性疾病、細(xì)菌性疾病和寄生蟲病等。其中，2016年以來導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的新型鵝星狀病毒病已經(jīng)成為限制養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的疾病之一。

鵝星狀病毒是一種無囊膜的二十面體的單股正鏈RNA病毒，病毒直徑28～30 nm。禽星狀病毒基因組全長6.9～7.9 kb，包含3個開放閱讀框(分別編碼ORF1a、ORF1b和ORF2蛋白)，5′和3′非編碼區(qū)和一個多聚A尾。新型鵝星狀病毒的分離和培養(yǎng)比較困難，目前該病毒的培養(yǎng)主要在鵝胚腎細(xì)胞、LMH細(xì)胞和9～11日齡的鵝胚，但在LMH細(xì)胞上無法產(chǎn)生細(xì)胞病變。

目前所研究的新型鵝星狀病毒分離于2017—2021年間，在其致病性、生物學(xué)特征以及致病機制方面均有一定研究。為進一步豐富對新型鵝星狀病毒的研究，本研究對2021年所采集的鵝星狀病毒陽性病料進行分離，并對分離的毒株進行全基因測序，分析其2基因核苷酸和氨基酸同源性以及編碼的衣殼蛋白與以往年份毒株的氨基酸變異位點的差異，同時構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析該毒株與其他分離毒株的遺傳進化關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病毒的分離鑒定

取采集保存的發(fā)病雛鵝的腎和肝組織，按照1∶5的比例加入無菌PBS進行研磨，收集病料研磨液加入青霉素和鏈霉素，反復(fù)凍融3次。12 000 r·min、4 ℃ 離心10 min后取上清，0.22 μm濾器過濾后于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

健康鵝胚在孵化箱孵化至10日齡后，通過絨毛尿囊膜途徑接種200 μL無菌病毒液，棄去24 h內(nèi)死亡的鵝胚，其余鵝胚死亡后及時進行處理。觀察7 d后，未死亡鵝胚于4 ℃ 冰箱處死，收集胚體和尿囊液進行傳代，直至穩(wěn)定致死鵝胚。

LMH細(xì)胞密度達(dá)到80%后，棄掉培養(yǎng)液，加入含有200 μL病毒液的培養(yǎng)基37 ℃ 孵育2 h后，棄去培養(yǎng)基。加入1% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基孵育72 h后，利用本實驗室所建立的方法，進行病毒的IFA鑒定。

1.2 GASTV ZM株鵝星狀病毒的全基因組擴增

根據(jù)GenBank收錄的新型鵝星狀病毒全基因組(GenBank accession number：MF772821)序列設(shè)計7對引物，對鵝星狀病毒全基因組進行分段擴增，PCR產(chǎn)物膠回收后連接pMD19-T載體，委托南京擎科生物科技有限公司測序。利用Chromas和DNAMAN軟件拼接后得到ZM株鵝星狀病毒全基因組。

1.3 遺傳進化分析

利用MegAlign軟件分析鵝星狀病毒ZM株2基因核苷酸和氨基酸同源性，同時將2基因編碼的氨基酸與2014—2020年間分離株進行比對，分析氨基酸變異位點。利用MEGA 7軟件，將鵝星狀病毒GASTV-ZM分離株全基因組與以往禽星狀病毒分離株和哺乳動物星狀病毒分離株全基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié) 果

2.1 病原分離

無菌病毒液通過絨毛尿囊膜途徑接種10日齡鵝胚，盲傳3代后可穩(wěn)定致死鵝胚。剖解鵝胚可見絨毛尿囊膜有白色絮狀沉淀，胚體水腫，體表出血嚴(yán)重，肝呈斑駁樣壞死。

2.2 病毒IFA檢測結(jié)果

利用本實驗室制備的鵝星狀病毒衣殼纖突蛋白多克隆抗體，進行IFA鑒定，結(jié)果顯示LMH細(xì)胞感染F3代鵝胚尿囊液，在LMH細(xì)胞質(zhì)中均可檢測到綠色特異性熒光，陰性對照組LMH細(xì)胞未見熒光信號(圖1)。表明已成功利用鵝胚分離到GASTV-ZM株鵝星狀病毒。

A. F3代鵝胚分離的ZM病毒；B. 對照組。FITC. 異硫氰酸熒光素；DAPI. 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；Merge. 融合A. ZM virus isolated from goose embryo of F3 generation; B. Control group. FITC. Fluorescein isothiocyanate; DAPI. 4’,6-diamidino-2-phenylindole; Merge. Merge圖1 間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色法檢測鵝星狀病毒Fig.1 Indirect immunofluorescence cytochemical staining for detection of goose astrovirus

2.3 全基因測序結(jié)果分析

本研究分離的鵝星狀病毒ZM株(GenBank accession number：MZ648231)基因組全長7 175 nt，其中包括10 nt的5′UTR和236 nt的3′UTR，包含3個開放閱讀框，分別為1、1和2基因，其中1a基因為3 255 nt，1b基因為1 551 nt，兩者編碼鵝星狀病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，包含跨膜域、絲氨酸蛋白酶、卷曲螺旋、病毒基因組連接蛋白、核定位信號以及RNA依賴性RNA聚合酶。2基因為2 115 nt，編碼病毒衣殼蛋白。

2.4 遺傳進化分析

2.4.12基因核苷酸和氨基酸同源性及編碼蛋白的變異位點分析 將不同年份所分離的鵝星狀病毒與2021年ZM分離株的2基因進行核苷酸和氨基酸同源性分析。如表1所示，ZM株2基因核苷酸和氨基酸與2014—2020年間分離毒株的同源性分別為96.7%～98.9%和96.9%～99.0%。

表1 ORF2基因同源性和氨基酸變異位點分析

2021年分離株GASTV-ZM與2014—2020年間中國分離毒株在2基因編碼蛋白氨基酸序列有較為顯著的差異，其中3個氨基酸突變位點與以往存在顯著差異，60(V-I)、97(L-P)、228(A-S)。其他突變主要集中在36(Y、H-S)、229(Q-P)、289(A-T)、376(T-A)、456(E-D)、540(L-Q)、614(A-N)。

2.4.2 鵝星狀病毒遺傳進化分析 將鵝星狀病毒GASTV-ZM株與GenBank已發(fā)表的禽星狀病毒和哺乳動物星狀病毒在全基因組核苷酸序列水平進行比對分析，并繪制遺傳進化樹。結(jié)果如圖2，GASTV-ZM株與2016年以來在我國流行的新型鵝星狀病毒處于同一進化分支，與2020分離株HNSQ-6株和XT1株同源性較高。與以往鵝星狀病毒FLX株、AHDY株和SCCD株處于同一進化分支不同的進化亞分支。同時哺乳動物星狀病毒(人星狀病毒)與禽星狀病毒(包括鴨星狀病毒、雞星狀病毒)處于不同的進化分支。

圖2 基于星狀病毒全基因組遺傳進化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the whole genome of astrovirus

3 討 論

禽星狀病毒感染可引起雞腎炎、火雞腸炎和鴨致死性肝炎等臨床疾病。自2016年以來，在安徽、江蘇、山東等省份流行一種以鵝痛風(fēng)為特征的新型鵝星狀病毒病。Zhao等研究表明，雞星狀病毒可感染LMH細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞病變，但是新型鵝星狀病毒感染LMH細(xì)胞并不能產(chǎn)生細(xì)胞病變，但是可以在細(xì)胞上進行穩(wěn)定傳代。本研究分離的ZM株通過絨毛尿囊膜途徑接種9～11日齡鵝胚，盲傳3代后可以穩(wěn)定致死鵝胚，可導(dǎo)致胚體表面明顯出血，肝呈斑駁樣壞死，部分鵝胚內(nèi)可見明顯的尿酸鹽顆粒沉積。病毒的IFA鑒定可見，鵝胚分離毒株可以檢測到特異性的綠色熒光。表明新型鵝星狀病毒ZM株可以在鵝胚上增殖，為后續(xù)進一步研究該病毒提供模型。

禽星狀病毒的2基因編碼其衣殼蛋白，衣殼蛋白作為其主要結(jié)構(gòu)蛋白，在蛋白水解成熟、病毒傳染性、病毒與宿主抗體和補體相互作用及病毒入侵宿主細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。本研究通過分析2基因核苷酸和氨基酸同源性發(fā)現(xiàn)，2014、2016和2017年間分離株與ZM株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別在96.7%～98.3%和96.9%～98.4%，2018、2019和2020年間分離株與ZM株的核苷酸同源性和氨基酸同源性分別在97.2%～98.9%和97.0%～99.0%。表明2021年ZM分離株與2018～2020年分離株在核苷酸和氨基酸水平上同源性高于2014～2017年間的分離株。同時2基因編碼的衣殼蛋白與以往毒株存在多個氨基酸突變，包含3個獨立的氨基酸突變，結(jié)合遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，ZM株與我國流行的新型鵝星狀病毒處于同一進化分支。表明新型鵝星狀病毒存在進一步變異的可能。

4 結(jié) 論

本研究從臨床發(fā)病雛鵝上成功分離到1株新型鵝星狀病毒ZM株，在鵝胚上可以穩(wěn)定傳代。遺傳進化分析表明ZM株與近幾年新型鵝星狀病毒分離株同源性高，且與新型鵝星狀病毒處于同一進化分支，存在進一步變異的可能。為進一步研究ZM鵝星狀病毒的致病性和致病機制奠定基礎(chǔ)。