林光耀,張米佳,葉 濤,聶 紅,甯海燕,王永周
(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,四川 瀘州 646000)
卵巢儲(chǔ)備功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)指卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞質(zhì)量和(或)數(shù)量下降,并伴有血清卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,F(xiàn)SH)升高和抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)降低,是導(dǎo)致女性生育能力下降和尋求輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technologies,ART)助孕的重要原因[1]。近年來,DOR的發(fā)生率從19%發(fā)展到26%并呈上升趨勢(shì)[2,3],但DOR的發(fā)病機(jī)理至今尚不明確。
目前西醫(yī)對(duì)DOR的治療主要包括口服雌孕激素類藥物、脫氫表雄酮、生長(zhǎng)激素和接受ART等方式,以調(diào)整月經(jīng)周期和改善妊娠結(jié)局。但長(zhǎng)期使用激素類藥物大大增加了患乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、腦卒中、卵巢癌等風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)較多的禁忌癥也限制了激素類藥物的應(yīng)用[5-7]。因此,尋找治療DOR療效顯著且更安全的方法,成為目前亟須解決的問題。中醫(yī)治療DOR具有多靶點(diǎn)、多途徑和適應(yīng)證廣等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[8]。前期臨床觀察發(fā)現(xiàn),葆青顆粒能明顯改善絕經(jīng)前女性性激素水平,在治療由激素變化引起的潮熱、失眠和眩暈等方面效果更是優(yōu)于雌激素且無不良反應(yīng),提示其對(duì)卵巢功能有保護(hù)作用[9,10]。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察葆青顆粒對(duì)DOR模型大鼠性激素水平和Bax、Bcl-2、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響,探討葆青顆粒治療DOR的作用與機(jī)制。本研究通過西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)2020767)。
清潔級(jí)10~12周齡雌性SD大鼠50只,體質(zhì)量(250±10)g,由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(川)2018-17。所有動(dòng)物自由飲水及攝食不含雌激素類飼料,室溫保持在23~24 ℃,濕度保持在40%~60%,自然晝夜交替,每2~3 d更換墊料1次。所有大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后連續(xù)2周行陰道脫落細(xì)胞學(xué)檢查。
葆青顆粒由熟地黃、山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞子、五味子、肉蓯蓉、龍骨組成,由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(批號(hào)XZ20000050)。
注射用環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide,CTX,批號(hào)H32020857)、戊酸雌二醇片(商品名:補(bǔ)佳樂,批號(hào)J20171038),西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院;瑞氏-姬姆薩復(fù)合染液(型號(hào)G1020),北京Solarbio科技有限公司;大鼠FSH試劑盒(型號(hào)34438)、黃體生成素(Luteinizing hormone,LH)試劑盒(型號(hào)30447)、雌二醇(estradiol,E2)試劑盒(型號(hào)30267)、AMH試劑盒(型號(hào)30630)和VEGF試劑盒(型號(hào)30908),睿信生物科技有限公司;重組Anti-Bax抗體(貨號(hào)ab32503),美國Abcam公司;Bcl-2抗體(貨號(hào)AF6139),中國Affinity公司;VEGF抗體(貨號(hào)19003-1-AP),美國Proteintech公司。
將10~12周齡雌性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,連續(xù)2周每日定時(shí)使用瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液對(duì)所有大鼠行陰道脫落細(xì)胞觀察。圖1示,大鼠正常動(dòng)情周期有以下特點(diǎn):動(dòng)情前期有核上皮細(xì)胞夾雜無核角化細(xì)胞;動(dòng)情期大量無核角化細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則;動(dòng)情后期有核上皮細(xì)胞、白細(xì)胞和無核角化細(xì)胞可同時(shí)被觀察到;動(dòng)情間期大量白細(xì)胞,偶見有核上皮細(xì)胞。篩選出正常動(dòng)情周期的50只大鼠,隨機(jī)選取10只納入正常組,余40大鼠一次性腹腔注射CTX 75 mg/kg誘導(dǎo)DOR模型[11],正常組大鼠注射相同劑量0.9%氯化鈉溶液。隨后2周每日定時(shí)對(duì)造模組大鼠行陰道脫落細(xì)胞學(xué)觀察,大鼠正常動(dòng)情周期為4~5 d,若動(dòng)情周期發(fā)生紊亂,并以動(dòng)情周期延長(zhǎng)為主要表現(xiàn),則提示造模成功[12]。
注:A.動(dòng)情前期;B.動(dòng)情期;C.動(dòng)情后期;D.動(dòng)情間期圖1 大鼠正常動(dòng)情周期陰道脫落細(xì)胞觀察(瑞氏-吉姆薩染色 ×100)
將38只成模大鼠(造模過程中意外死亡2只大鼠)按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、補(bǔ)佳樂組、葆青顆粒高劑量組(葆青高劑量組)和葆青顆粒低劑量組(葆青低劑量組),模型組和葆青低劑量組各9只大鼠,余各組均納入10只大鼠。葆青高、低劑量組大鼠連續(xù)3周每日定時(shí)灌胃葆青顆粒9 g/kg、3 g/kg,補(bǔ)佳樂組大鼠灌胃戊酸雌二醇片(0.21 mg/kg),正常組和模型組大鼠均灌胃相同容積,0.9%氯化鈉溶液。
末次給藥后所有大鼠均禁食禁飲12 h,水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血,收集上清-80 ℃?zhèn)錂z;萬分位電子天平稱重大鼠雙側(cè)卵巢組織,結(jié)果保留3位小數(shù);左側(cè)卵巢組織放入4%多聚甲醛溶液中固定,4 ℃?zhèn)錂z;右側(cè)卵巢組織勻漿后-80 ℃?zhèn)錂z。
2.3.1 一般情況 觀察并記錄大鼠大小便情況、精神狀態(tài)與皮毛疏密程度。卵巢指數(shù)=雙側(cè)卵巢(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)×100%。
2.3.2 卵巢組織病理學(xué)觀察 取出固定液中的卵巢組織,石蠟包埋、切片、HE染色,封片后在光鏡下觀察卵泡、黃體及顆粒細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化。
2.3.3 血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢組織VEGF水平檢測(cè) ELISA檢測(cè)血清FSH、AMH、LH、E2和卵巢組織VEGF水平。以上操作均按照試劑說明書步驟進(jìn)行。
2.3.4 卵巢組織中Bax、Bcl-2、VEGF蛋白表達(dá) 使用免疫組化法測(cè)定各組大鼠卵巢組織中Bax、Bcl-2、VEGF蛋白表達(dá)。取上述完成石蠟包埋的卵巢組織切片、脫水,消除過氧化物酶活性,一抗(濃度分別為1∶100、1∶100和1∶200)孵育過夜,二抗孵育30 min,DAB顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、封片,光鏡下觀察并選取卵泡數(shù)量較多的區(qū)域拍片。運(yùn)用Image J圖像處理軟件,計(jì)算每張圖片的光密度值。
模型組和補(bǔ)佳樂組于灌胃第1周內(nèi)分別意外死亡1只和2只大鼠。與正常組比較,模型組大鼠精神差,對(duì)外界刺激反應(yīng)較遲緩,進(jìn)食與飲水量減少,部分大鼠出現(xiàn)脫毛、大便稀溏或干燥、尿血。與模型組比較,各藥物干預(yù)組大鼠精神狀態(tài)佳,對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏,進(jìn)食與飲水量未見明顯改變,毛色光滑,大小便未見異常。
表1示,與正常組比較,模型組大鼠卵巢濕重和卵巢指數(shù)顯著降低(P<0.05);與模型組比較,各治療組卵巢濕重和卵巢指數(shù)均增高(P<0.05)。
表1 各組大鼠卵巢濕重與卵巢指數(shù)比較
圖2示,與正常組比較,模型組卵巢組織中發(fā)育卵泡和顆粒細(xì)胞層較少,閉鎖卵泡數(shù)較多,未見優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育;與模型組比較,各治療組卵巢組織中均可見各級(jí)卵泡及黃體,卵泡形態(tài)規(guī)則,顆粒細(xì)胞層及卵泡液含量豐富。
注:A.正常組;B.模型組;C.補(bǔ)佳樂組;D.葆青高劑量組;E.葆青低劑量組圖2 大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察(HE ×100)
因正常組大鼠麻醉死亡3只,未收集到血液標(biāo)本,故總采集血清標(biāo)本42件。表2示,與正常組比較,模型組大鼠FSH和LH水平升高,AMH、E2和VEGF水平下降(P<0.05)。與模型組比較,各治療組表現(xiàn)為FSH、LH水平下降和AMH、E2、VEGF水平升高(P<0.05)。
表2 各組大鼠血清FSH、LH、AMH、E2和卵巢組織VEGF水平比較
圖3表3示,Bax、Bcl-2、VEGF均表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞、各級(jí)卵泡和黃體細(xì)胞中。與正常組比較,模型組中Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng),Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)減弱(P<0.05);與模型組比較,各治療組Bax蛋白表達(dá)減弱,Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。
注:A.正常組;B.模型組;C.補(bǔ)佳樂組;D.葆青高劑量組;E.葆青低劑量組圖3 大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、VEGF免疫組化染色圖(×400)
表3 免疫組化法測(cè)定各組大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、VEGF表達(dá)結(jié)果比較
現(xiàn)國內(nèi)外對(duì)DOR的診斷尚缺乏特異性指標(biāo)和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[1],故在臨床診療中需結(jié)合患者年齡、臨床表現(xiàn)及性激素水平做出綜合判斷[13],如基礎(chǔ)FSH>6.5 mIU/mL、竇卵泡計(jì)數(shù)<12或AMH<1.0 ng/mL,則提示卵巢儲(chǔ)備功能開始下降。其中AMH分泌具有不受月經(jīng)周期和外源性類固醇干擾等優(yōu)勢(shì),其敏感性高于基礎(chǔ)FSH,能較早地反映卵巢儲(chǔ)備功能水平[14]。本研究模型組大鼠在注射CTX后出現(xiàn)血清FSH和LH水平升高,E2和AMH水平降低,卵泡和黃體數(shù)量明顯減少,剩余卵泡趨于閉鎖,提示采用一次性腹腔注射CTX 75 mg/kg方法誘導(dǎo)DOR模型成功,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。
DOR的發(fā)病機(jī)制尚未被完全闡明。目前諸多研究表明,細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白與DOR疾病的發(fā)生關(guān)系密切,其中Bax和Bcl蛋白對(duì)卵泡形成和閉鎖的作用機(jī)制更是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[4]。隨著對(duì)Bcl蛋白作用機(jī)制的深入探索,現(xiàn)根據(jù)其對(duì)細(xì)胞作用的不同被分為2個(gè)亞家族,首先是抗凋亡蛋白家族,包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-1和 A1;其次是促凋亡蛋白家族,包括Bax、Bak和Bok;其中Bax基因所編碼的BCL2L4蛋白在激活后與Bcl-2蛋白形成異源二聚體,通過改變線粒體外膜通透性,誘導(dǎo)線粒體腫脹、破裂,促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C釋放,同時(shí)激活半胱氨酸天冬蛋白酶(caspases),啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15-17]。而Bcl-2通過抑制Bax釋放細(xì)胞色素C,以阻斷下游相關(guān)凋亡蛋白酶激活。因此在卵泡發(fā)育過程中,Bcl-2高表達(dá)可抑制卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中caspases活性,減少卵泡凋亡,而高Bax和/或低Bcl-2表達(dá)以及二者高比值則促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡[18-20]。此外,手術(shù)對(duì)卵巢血供以及周圍組織正常解剖結(jié)構(gòu)的損傷造成卵巢新生血管減少,導(dǎo)致卵泡生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏,最終使卵泡中VEGF水平降低,閉鎖卵泡數(shù)量增加,卵巢儲(chǔ)備功能逐漸下降[21]。葆青顆粒的前期臨床觀察發(fā)現(xiàn),諸多患者于婦科手術(shù)后和圍絕經(jīng)期出現(xiàn)潮熱、月經(jīng)紊亂以及性激素水平改變等一系列卵巢儲(chǔ)備功能下降的臨床表現(xiàn),通過服用葆青顆粒后以上癥狀均有顯著改善[9,10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,DOR模型組大鼠表現(xiàn)出FSH和LH水平升高,E2、AMH和VEGF水平下降,Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)及Bcl-2蛋白表達(dá)減弱。故推測(cè)Bax與Bcl-2水平比例失衡和VEGF表達(dá)降低導(dǎo)致卵泡生成和發(fā)育障礙,從而影響了血清激素水平的變化。
中醫(yī)學(xué)雖無對(duì)DOR病名的記載,但其臨床表現(xiàn)屬于中醫(yī)學(xué)“血枯”“年未老經(jīng)水?dāng)唷薄伴]經(jīng)”和“不孕”等范疇[22]?!陡登嘀髋啤份d:“經(jīng)水早斷,似乎腎水衰涸”,認(rèn)為腎乃先天之本,主藏精,精足化血,精虧血少,血海難溢,故經(jīng)水早斷;《婦人大全良方》中指出,經(jīng)水由心血所化,腎氣充盛,沖任通利,經(jīng)血滿盈,月經(jīng)宣和,然血虛經(jīng)枯無以滋養(yǎng),經(jīng)則難行也,故滋腎填精、養(yǎng)陰益血為其主要治法。葆青顆粒重用熟地黃補(bǔ)腎填精養(yǎng)血為君藥;山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞子補(bǔ)肝腎、益精血,并增強(qiáng)熟地黃滋陰補(bǔ)血之力,以上4藥合為臣藥;佐以溫補(bǔ)之品肉蓯蓉,以契“陽中求陰”之妙;協(xié)五味子和龍骨補(bǔ)腎寧心,心腎相交,水火既濟(jì),針對(duì)DOR患者“腎水衰涸”表現(xiàn)恰好藥證相符。同時(shí),該方中大部分藥物具有直接作用于細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的作用,如梓醇作為熟地黃提取物,可通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值參與細(xì)胞凋亡過程[23];山藥的主要成分薯蕷皂苷元除具備以上作用外,還能作用于VEGF調(diào)節(jié)血管生成[24];菟絲子和枸杞子具有抑制卵巢細(xì)胞凋亡、改善性激素水平等功效[25,26]。這也是葆青顆粒應(yīng)用于DOR的現(xiàn)代藥理學(xué)機(jī)制。
綜上所述,葆青顆粒可通過降低卵巢組織中Bax蛋白表達(dá),增強(qiáng)Bcl-2和VEGF蛋白表達(dá),從而改善DOR模型大鼠性激素水平,還可通過減少卵巢內(nèi)卵泡閉鎖,增加顆粒細(xì)胞層及卵泡液含量起到治療DOR的作用。