封麗梅 林淼 姜茂成 程秀花 吉慧敏

摘要：為探究電子供體對瘤胃微生物發(fā)酵向日葵秸稈產(chǎn)C2～C6脂肪酸的影響，采用體外連續(xù)傳代和高通量測序技術(shù)，比較添加乙醇或乳酸對脂肪酸產(chǎn)量及細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，添加乙醇和乳酸顯著提高了總C2～C6脂肪酸的產(chǎn)量，乙醇提高了乙酸、戊酸和己酸產(chǎn)量，乳酸提高了丙酸、丁酸、戊酸和己酸產(chǎn)量。與對照組相比，乙醇組的擬桿菌門相對豐度下降，而變形菌門相對豐度上升;乳酸組的變形菌門相對豐度下降，而放線菌門相對豐度上升。添加乙醇或乳酸對相對豐度前5的真菌菌門無顯著影響。添加2種電子供體都顯著改變了細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)。添加乙醇顯著提高薩特氏菌屬、解琥珀酸菌屬和脫硫弧菌屬的相對豐度，添加乳酸顯著提高巨型球菌屬、Shuttleworthia、互營球菌屬、光岡菌屬、未定義的普雷沃氏菌的相對豐度。在種水平上，普雷沃氏菌、亨氏丁酸弧菌、埃氏巨型球菌與丁酸、戊酸產(chǎn)量呈顯著相關(guān)。

關(guān)鍵詞：乙醇;乳酸;瘤胃微生物;向日葵秸稈;C2～C6脂肪酸

中圖分類號：X712 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）09-0247-06

我國是農(nóng)業(yè)大國，主要農(nóng)作物秸稈產(chǎn)生量為9.84億t，可收集量達(dá)8.24億t，占全球秸稈總產(chǎn)量的20%左右[1]。2019年全球向日葵總種植面積約為2 590萬hm2，大部分地區(qū)在向日葵收獲后采用焚燒的方式處理，不僅污染環(huán)境，也浪費(fèi)能源[2-5]。農(nóng)作物秸稈含有很高的纖維性碳水化合物，對其進(jìn)行有效的降解利用和轉(zhuǎn)化已成為研究的熱點(diǎn)，而生物質(zhì)的資源化和能源化利用對能源發(fā)展和環(huán)境保護(hù)具有重要的價值和意義。目前生物法降解廢棄物，主要有酶處理法和微生物處理法，用于生產(chǎn)甲烷、乙醇和揮發(fā)性脂肪酸[6-8]。因具有反應(yīng)條件溫和、污染小的特點(diǎn)，具有巨大的應(yīng)用潛力[9-10]。

向日葵秸稈作為豐富的木質(zhì)纖維素資源，可以發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，也可直接飼喂反芻動物[11-12]。瘤胃微生物棲息在反芻動物瘤胃中，是分解利用纖維類物質(zhì)效率最高的天然微生態(tài)體系[13]。瘤胃微生物可實(shí)現(xiàn)厭氧發(fā)酵秸稈，獲得甲烷和揮發(fā)性脂肪酸，這在新型高值化利用方面也具有深度挖掘的價值[14]。厭氧發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸主要通過水解和產(chǎn)酸步驟形成，其中，戊酸和己酸是乙酸、丙酸和丁酸進(jìn)一步合成的產(chǎn)物，并且可提供更多能量[15-16]。利用乙醇或乳酸作為電子供體，在特定微生物的作用下進(jìn)行脂肪酸β氧化的逆循環(huán)實(shí)現(xiàn)短鏈脂肪酸碳鏈延長，提高戊酸和己酸的產(chǎn)量[17-18]。相關(guān)研究表明，乙醇有助于奶牛瘤胃細(xì)菌發(fā)酵纖維類底物產(chǎn)生更多的乙酸和己酸，該類電子供體具備幫助細(xì)菌利用有機(jī)廢棄物生產(chǎn)己酸的潛力[19-20]。目前，對向日葵秸稈厭氧發(fā)酵生產(chǎn)C2～C6脂肪酸的能力和主要的微生物群落少有報道。

本試驗(yàn)研究瘤胃液與向日葵秸稈共培養(yǎng)利用乙醇或乳酸的C2～C6脂肪酸產(chǎn)量的變化，闡明微生物群落結(jié)構(gòu)特征，揭示瘤胃發(fā)酵向日葵秸稈的產(chǎn)酸特點(diǎn)，同時為向日葵秸稈的有效利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

向日葵秸稈于2020年11月取自揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀?。風(fēng)干處理后的向日葵秸稈（65 ℃，干燥 48 h），再粉碎過40目標(biāo)準(zhǔn)篩，放入樣本瓶中保存?zhèn)溆?。發(fā)酵液取自干奶期荷斯坦奶牛的瘤胃，瘤胃液經(jīng)采集和過濾后，立刻于39 ℃水浴帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 厭氧發(fā)酵

礦物鹽培養(yǎng)緩沖液：1.10 mg/L CaCl 2·2H 2O，0.83 mg/L MnCl 2·4H 2O，0.08 mg/L CoCl 2·6H 2O，0.67 mg/L FeCl 3·6H 2O，5.83 mg/L NaHCO 3，0.95 mg/L Na 2HPO 4，1.03 mg/L KH 2PO 4，0.10 mg/L MgSO 4·7H 2O。在礦物鹽緩沖液中加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的刃天青，攪拌并持續(xù)通入CO 2（純度：99.9%以上）約3 h （pH值6.8±0.1）后密封備用。

稱取0.16 g向日葵秸稈于150 mL干燥厭氧培養(yǎng)瓶中，加入礦物鹽培養(yǎng)緩沖液15 mL，硫化鈉溶液（濃度2.5%）0.15 mL和瘤胃液2 mL，膠塞密封。將培養(yǎng)瓶放于39 ℃培養(yǎng)箱靜置發(fā)酵72 h。每3 d將2 mL混合發(fā)酵液取出，接種到含相同底物和新鮮礦物鹽緩沖液的新培養(yǎng)瓶中，其他操作同上，共培養(yǎng)8代。以不加乙醇和乳酸為對照組，試驗(yàn)組加乙醇或乳酸（0.2 mL），每組4個平行。

1.3 pH值和C2～C6脂肪酸測定

收集第8代的發(fā)酵混合液，測定發(fā)酵液pH值（PB-21 型pH計，Sartorius）。脂肪酸測定參照Lin等的方法[21]：取2 mL發(fā)酵液，離心（12 000 r/min，20 min）后，取上清液1 mL，加入0.2 mL的偏磷酸（濃度25%，含60 mmol/L巴豆酸），-20 ℃保存，測定前取出解凍后離心（轉(zhuǎn)速和時間同前），過濾上清液（0.22 μm水相濾膜），上機(jī)測定C2～C6脂肪酸的含量。氣相色譜條件：毛細(xì)柱（Agilent J & W Advanced Capillary GC columns，30 m×0.32 mm×0.25 μm），柱溫100 ℃，F(xiàn)ID檢測器，檢測器溫度 200 ℃，載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣量1.0 μL。

1.4 微生物群落分析

用EDTA緩沖溶液（10 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl，100 mmol/L tris/HCl，pH值8.0）30 mL將固液混合發(fā)酵液洗滌至攪拌杯中，均質(zhì) 2 min，經(jīng)無菌紗布過濾入離心管，離心（12 000 r/min，30 min），棄上清，用1 mL提取緩沖液復(fù)懸沉淀，送北京諾禾致源生物技術(shù)有限公司測序分析。細(xì)菌和真菌的擴(kuò)增引物分別為16S V4區(qū)的515F和806R、ITS 5-1737F和ITS 2-2043R。菌群結(jié)構(gòu)分析參照Lin等的方法[21]：將一致性>97%的序列聚類為OTUs，從標(biāo)準(zhǔn)化OTUs （operational taxonomic units）數(shù)據(jù)中計算微生物群落結(jié)構(gòu)，對相對豐度與C2～C6脂肪酸產(chǎn)量進(jìn)行Spearman 相關(guān)分析。

1.5 統(tǒng)計方法

用單因素ANOVA進(jìn)行差異顯著性分析，用Tukeys法進(jìn)行兩兩比較（SPSS 18.0）。當(dāng)方差齊性檢驗(yàn)顯著時，用非參數(shù)檢驗(yàn)重新分析數(shù)據(jù)在3組間的差異顯著性。表格內(nèi)的數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理pH值和產(chǎn)酸比較

由表1可知，與對照組相比，添加乙醇和乳酸作為電子供體顯著降低pH值，并且乳酸組pH值最低。添加乙醇和乳酸顯著提高了總酸的產(chǎn)量，與對照組相比，乙醇和乳酸產(chǎn)量分別提高了76.1%和76.9%。對單一脂肪酸分析結(jié)果表明，添加乙醇顯著提高了乙酸、戊酸和己酸含量，分別提高了71.4%、206.3%和1 236.4%。添加乳酸顯著提高丙酸、丁酸、戊酸和己酸產(chǎn)量，分別提高了86.3%、228.6%，737.5%和290.9%。乙醇組乙酸和己酸產(chǎn)量最高，乳酸組丙酸、丁酸和戊酸產(chǎn)量最高。

2.2 不同處理多樣性分析

由表2可知，與對照組相比，乙醇組細(xì)菌和真菌的Chao1（豐富度）指數(shù)和Shannon（多樣性）指數(shù)顯著降低，細(xì)菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別下降了15.4%和24.6%，真菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別下降了16.3%和30.4%。與對照組相比，乳酸組與乙醇組相似，細(xì)菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別下降了25.4%和46.3%，真菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)分別下降了27.5%和47.6%。乳酸對瘤胃細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性影響大于乙醇。

2.3 不同處理相對豐度和相關(guān)性分析

門水平上相對豐度的比較分析見表3。對照組和電子供體添加組的厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門的相對豐度總和均>95%，且厚壁菌門>擬桿菌門>變形菌門。與對照組相比，添加乙醇顯著降低擬桿菌門的相對豐度，降低43.1%;顯著提高變形菌門的相對豐度，提高72.5%。添加乳酸顯著降低變形菌門的相對豐度，降低57.6%;顯著提高放線菌門的相對豐度，提高113.7%。

對照組和電子供體添加組的擔(dān)子菌門和子囊菌門的相對豐度總和均>67%，是主要的優(yōu)勢菌門，擔(dān)子菌門的相對豐度>子囊菌門。與對照組相比，添加乙醇或乳酸對相對豐度前5的真菌門無顯著影響。

屬水平上各組細(xì)菌和真菌相對豐度的差異見圖1。從圖1-A可知，與對照組相比，添加乙醇顯著提高脫硫弧菌屬、薩特氏菌屬和解琥珀酸菌屬的相對豐度，分別提高191.0%、294.4%和 1 157.6%;添加乳酸顯著提高巨型球菌屬、Shuttleworthia、互營球菌屬、光岡菌屬、未定義的普雷沃氏菌的相對豐度，分別提高7 700%、345.3%、1 968.2%、281.0%和101.4%。由圖1-B可知，在屬水平上，與對照組相比，添加乙醇顯著提高絲孢菌屬和畢赤酵母菌屬的相對豐度，分別提高403.1%和236.6%。添加乳酸顯著提高節(jié)擔(dān)菌屬的相對豐度，提高40.5%。

在種水平上，挑選r2≥0.8的數(shù)據(jù)分析，從表4可以看出，在菌相對豐度與產(chǎn)酸量之間，布氏普雷沃氏菌與丙酸呈顯著正相關(guān)，而亨氏丁酸弧菌與丙酸呈極顯著負(fù)相關(guān)。埃氏巨型球菌和普雷沃氏菌 sp. DJF CP65與丁酸和戊酸呈極顯著正相關(guān)。梅里科拉節(jié)擔(dān)與丁酸和戊酸呈極顯著正相關(guān)，粗糙肉齒菌與丁酸呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

瘤胃發(fā)酵有機(jī)物產(chǎn)生的有機(jī)酸增多會導(dǎo)致pH值降低。本研究中，瘤胃發(fā)酵在乙醇和乳酸都提高了體外總脂肪酸的產(chǎn)量，同時降低了pH值，說明pH值的下降可能是由于有機(jī)酸產(chǎn)量增加導(dǎo)致，同時推測由于乙醇和乳酸作為電子供體在降解纖維為有機(jī)酸中提供了底物，使發(fā)酵纖維更徹底。3組的發(fā)酵液pH值為5.77～6.36，其中乳酸組最低。瘤胃液pH值若長時間低于5.6會導(dǎo)致革蘭氏陰性菌的死亡[22]，本試驗(yàn)乳酸組的細(xì)菌和真菌的豐富度和多樣性均最低，推測原因是低pH值殺死了不耐酸的微生物。傳統(tǒng)的戊酸從甘油中獲得，己酸從椰子油中獲得，但得率很低。厭氧發(fā)酵有機(jī)廢棄物可以增加己酸的產(chǎn)量[20]，添加乙醇可有效促進(jìn)高纖維底物中己酸的產(chǎn)量[8，19]。Chwialkowska等比較乙醇或乳酸對乳清厭氧發(fā)酵的產(chǎn)酸效果差異發(fā)現(xiàn)，乳酸更能提高戊酸的產(chǎn)量[23]。本試驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)戊酸和己酸產(chǎn)量隨著添加乙醇或乳酸而升高，說明乙醇和乳酸在向日葵秸稈與瘤胃液共培養(yǎng)生產(chǎn)高附加值化學(xué)品中具有潛力。

埃氏巨型球菌是瘤胃的固有細(xì)菌，在研究奶牛乳脂降低中被認(rèn)為可利用乳酸[24]。相關(guān)報道，該菌可利用葡萄糖和乳酸生產(chǎn)丁酸、戊酸和己酸[20，25]。Weimer等認(rèn)為，該菌對葡萄糖的利用率低，且不具有工業(yè)化合成己酸的潛力[26]。Kim等認(rèn)為，該菌可以轉(zhuǎn)化葡萄糖獲得高濃度己酸[27]。本研究中，乙醇促進(jìn)了戊酸和己酸的產(chǎn)生，乳酸促進(jìn)了丙酸、丁酸、戊酸和己酸的產(chǎn)生，并且埃氏巨型球菌相對豐度與丁酸、戊酸產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，推測該菌與存在乙醇或乳酸的厭氧發(fā)酵向日葵秸稈時的產(chǎn)物可能是丁酸和戊酸。普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，在瘤胃中分布廣泛，數(shù)量多，包括半纖維素分解菌和蛋白分解菌，降解蛋白質(zhì)的產(chǎn)物是氨基酸和氨，降解碳水化合物的產(chǎn)物是丙酮酸和揮發(fā)性脂肪酸[28]。因此，普雷沃氏菌可增加瘤胃內(nèi)乙酸和丁酸的比例[29]。本研究中，布氏普雷沃氏菌相對豐度與丙酸產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，普雷沃氏菌 sp. DJF CP65相對豐度與丁酸和戊酸產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，說明該菌能夠在產(chǎn)丙酸、丁酸和戊酸中發(fā)揮作用。Yang 等報道在含乙醇的污泥厭氧發(fā)酵液中，脫硫弧菌屬是優(yōu)勢菌屬，稻秸瘤胃發(fā)酵液中添加乙醇也提高了脫硫弧菌屬的相對豐度[8，30]，本試驗(yàn)結(jié)果與這些結(jié)論相似，說明脫硫弧菌屬在利用乙醇作為碳源代謝產(chǎn)己酸過程中有潛在作用。

瘤胃厭氧真菌可以在木質(zhì)纖維素底物降解過程中分泌一系列的粗纖維降解酶，從而達(dá)到預(yù)處理底物并釋放可溶性糖的作用，尤其與甲烷菌共培養(yǎng)后，其粗纖維降解能力增強(qiáng)[31]。梅里科拉節(jié)擔(dān)菌屬于擔(dān)子菌亞門，目前對該菌的研究較少。Sun等認(rèn)為，該菌具有獨(dú)特的系統(tǒng)發(fā)育地位以及對環(huán)境的適應(yīng)性很強(qiáng)[32]。Skalskid等在小鼠和人的疾病模型研究中發(fā)現(xiàn)，該菌具有耐藥性且可能加劇腸道菌群結(jié)構(gòu)變化并加重病情[33]。本研究中，梅里科拉節(jié)擔(dān)菌相對豐度與丁酸和戊酸產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)。表明該菌在瘤胃體外發(fā)酵產(chǎn)酸中有潛在作用，但是否能作為發(fā)酵產(chǎn)酸菌有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在向日葵秸稈的瘤胃體外發(fā)酵體系中，添加乙醇或乳酸顯著提高C2～C6總酸的產(chǎn)量。乙醇組己酸產(chǎn)量最高，乳酸組戊酸產(chǎn)量最高，二者對瘤胃細(xì)菌的影響大于真菌。埃氏巨型球菌屬、普雷沃氏菌屬、脫硫弧菌屬和梅里科拉節(jié)擔(dān)真菌在本試驗(yàn)培養(yǎng)體系中實(shí)現(xiàn)碳鏈衍生發(fā)酵產(chǎn)酸中有潛在作用。

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