孔順，王菲菲，張少楠，張葉明

（蕪湖市第二人民醫(yī)院，安徽蕪湖 241000）

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，臨床上有較高的發(fā)病率和死亡率，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，對患者生命造成嚴(yán)重的威脅[1]。目前，臨床根治肺癌的唯一方法是手術(shù)切除，但對于不適合行手術(shù)切除的患者，其化療、放療療效尚不能令人十分滿意。因此，尋求一種可重復(fù)、創(chuàng)傷小、便捷的治療方法是目前具有重要意義的策略。越來越多的研究表明，中藥單體化合物由于其易合成、毒副作用較低、療效穩(wěn)定等特點，有望成為未來抗腫瘤理想的藥物。蒼耳子為菊科植物蒼耳Xanthium sibiricumPatr.干燥成熟帶總苞的果實，味甘，性溫，入肺、肝經(jīng)，可祛風(fēng)濕、通鼻竅，主治風(fēng)濕痹痛、頭痛鼻淵、皮膚癢疹、麻風(fēng)病，主要含有水溶性苷類、倍半萜內(nèi)酯類、揮發(fā)油類、脂肪油類、酚酸類及其他化合物，有降血糖、抗過敏、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤的藥理作用[2]。蒼耳亭（Xanthatin）為蒼耳的主要活性成分之一，屬于蒼耳屬植物中倍半萜內(nèi)酯類化學(xué)成分[3]。有研究表明，蒼耳亭對非小細(xì)胞肺癌的生長存在顯著的抑制作用，且對正常肺上皮細(xì)胞生長影響較小[4-5]。提示其可能成為具有高效低毒特點的抗肺癌候選藥物，但其作用機制尚不完全明確。有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）結(jié)合蛋白1（4E-BP1）信號通路在細(xì)胞的生存、生長與增殖中起中心調(diào)控作用，該信號通路的傳導(dǎo)異常與多種惡性腫瘤有關(guān)[6]，已成為腫瘤治療的新靶點。為進(jìn)一步明確蒼耳亭的抗肺癌的作用及機制，本研究構(gòu)建了荷Lewis肺癌大鼠模型，觀察蒼耳亭對肺癌大鼠腫瘤、能量代謝及mTOR/4E-BP1信號通路的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物40只清潔級雄性大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（蘇）2016-0003。在實驗室適宜溫濕度的環(huán)境中對大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥物、試劑與儀器蒼耳亭，購自南京世洲有限公司，分子結(jié)構(gòu)見圖1，純度98.5%，批號：26791-73-1，使用前用二甲基亞砜（DMSO）配制，存于-20℃冰箱中備用。mTOR抗體、磷酸化（p）-4E-BP1抗體（美國Abcam公司）；三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）（美國Sigma公司）；線粒體膜電位（MMP）檢測試劑盒（JC-1法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。GTR16-2型冷凍離心機（北京時代北利離心機有限公司）；DMI3000B倒置顯微鏡（德國Leica公司）；TC-100B恒溫?fù)u床（上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；E2695-2489高效液相色譜儀（美國Waters公司）。

圖1 蒼耳亭化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of Xanthatin

1.3 動物造模大鼠Lewis肺癌細(xì)胞（購自美國ATCC公司），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中以含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，14 d后取生長狀態(tài)最佳的細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)節(jié)其密度為5×106個/mL，以每只0.2 mL在大鼠右腋下接種。接種7 d后，造模大鼠右腋下可觸及瘤塊。測量瘤體質(zhì)量和體積。40只大鼠在10 d后均成瘤，提示肺癌模型制備成功。

1.4 動物分組與給藥將40只成模大鼠隨機分為模型組，蒼耳亭低、中、高劑量組，每組10只。模型制備成功后第2天開始進(jìn)行給藥干預(yù)：模型組給予等體積的生理鹽水灌胃；蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠分別給予10、20、40 mg/kg蒼耳亭灌胃。每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肺癌組織病理形態(tài) 取大鼠肺癌組織，4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切片（厚度為5μm）。每組取3張切片，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色1 min，自來水沖洗切片1 min，鹽酸-酒精分色3 s，流水沖洗5 min，伊紅染色10 s，梯度酒精上行脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各20 min，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.2 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的d UTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法測定肺癌細(xì)胞凋亡率 取“1.5.1”項切片，經(jīng)脫蠟、梯度乙醇溶液浸泡后，參照TUNEL染色試劑盒說明書的步驟進(jìn)行染色，經(jīng)漂洗、脫水、透明后，用中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察切片并拍照，每個切片隨機選取5個視野。

1.5.3 高效液相色譜法（HPLC）檢測肺癌組織中ATP、ADP和AMP含量 取大鼠肺癌組織，加入0.4 mol/L冰預(yù)冷的高氯酸（肺癌組織∶高氯酸=1∶5），采用超聲粉碎機粉碎、制成勻漿。于4℃、10 000 r/min離心（離心半徑6.2 cm）10 min，取上清液100μL，加入1 mol/L碳酸鉀與甲醇混合液（體積比4∶1）中和高氯酸50μL。于4℃、10 000 r/min（離心半徑6.2 cm）離心10 min，取上清液100μL加水100μL稀釋，應(yīng)用HPLC儀檢測。色譜柱：Phenomenex Luna C18柱；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：室溫；樣品溫度：4℃；檢測波長：254 nm；流動相A：磷酸二氫鈉溶液；流動相B：甲醇。

1.5.4 JC-1法檢測肺癌組織MMP水平 組織線粒體的分離及JC-1染色工作液的配制均按照試劑盒說明書操作。JC-1染色緩沖液將染色工作液稀釋成原來的5倍，在稀釋后的JC-1染色工作液中加入純化的線粒體。在MMP較高時，產(chǎn)生紅色熒光，JC-1為聚合物；MMP較低時，產(chǎn)生綠色熒光，JC-1為單體。MMP水平的變化情況可通過熒光顏色的變化來進(jìn)行觀察。采用流式細(xì)胞儀分別測定單體和聚合物的值，以聚合物與單體的比值表示MMP水平。

1.5.5 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot）法檢測肺癌組織中mTOR、p-4E-BP1蛋白表達(dá) 取肺癌組織置于冰上，剪碎放入研磨器中，加入200μL蛋白裂解液和2μL PMSF，冰上研磨1 min直至充分裂解。以14 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min得到上樣緩沖液，用二喹啉甲酸（BCA）法測定上樣緩沖液中總蛋白濃度。將樣品稀釋到20μL相同濃度，加入4μL上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min。加入電泳緩沖液至電泳槽中，穩(wěn)定電壓80 V電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至轉(zhuǎn)移膜上。封閉，在封閉液中放入轉(zhuǎn)移膜，置于37℃恒溫?fù)u床上，低速搖動2 h。分別加入TBS稀釋的一抗mTOR、p-4E-BP1（1∶2 000稀釋），內(nèi)參β-actin（1∶2 000稀釋）4℃過夜。洗膜后加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗（1∶10 000稀釋），室溫?fù)u床反應(yīng)2 h。TBS洗滌后，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，曝光，拍攝蛋白顯影條帶，應(yīng)用ImageJ軟件分析目的蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，用t檢驗比較2組的差異性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠瘤體質(zhì)量和體積比較與模型組比較，蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠瘤體的質(zhì)量和體積均顯著減小（P＜0.05），且隨劑量增加呈逐漸遞減趨勢，其中，高劑量組瘤體質(zhì)量和體積降低最為明顯。見表1。

表1 各組大鼠瘤體質(zhì)量和體積比較Table 1 Comparison of mass and volume of tumor body between various groups of rats（±s）

表1 各組大鼠瘤體質(zhì)量和體積比較Table 1 Comparison of mass and volume of tumor body between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與蒼耳亭低劑量組比較；③P＜0.05，與蒼耳亭中劑量組比較

組別模型組蒼耳亭低劑量組蒼耳亭中劑量組蒼耳亭高劑量組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10瘤體質(zhì)量/g 20.5±3.2 15.8±2.8①11.3±3.4①②8.4±4.1①②③24.152＜0.001瘤體體積/mm3 5012.3±310.2 3520.1±266.1①2763.5±276.4①②2071.4±296.5①②③192.007＜0.001

2.2 各組大鼠肺癌組織病理形態(tài)學(xué)變化比較模型組和蒼耳亭低劑量組大鼠肺組織可觀察到細(xì)胞形態(tài)大小不一，且排列無規(guī)則，有明顯的癌巢出現(xiàn)，細(xì)胞分化差，核大深染，多見核分裂相，且肺組織形態(tài)破壞嚴(yán)重；蒼耳亭中劑量組和高劑量組未見明顯癌巢，肺組織形態(tài)完整，細(xì)胞形態(tài)均一、分化較好，且蒼耳亭高劑量組肺組織情況優(yōu)于中劑量組。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠肺癌組織病理形態(tài)學(xué)變化比較（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of pathologicalchanges of lung tissues between various groups of rats（by HE staining，×200）

2.3 各組大鼠肺癌細(xì)胞凋亡情況比較模型組，蒼耳亭低、中、高劑量組均可見凋亡細(xì)胞散在于癌細(xì)胞之間，胞漿減少，核內(nèi)可見棕黃色顆粒物質(zhì)，呈核碎裂、核固縮，或核溶解現(xiàn)象。見圖3。與模型組比較，蒼耳亭低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯增加（P＜0.05），且隨劑量增加呈逐漸遞增趨勢，其中，蒼耳亭高劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于低劑量組和中劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

2.4 各組大鼠肺癌組織ATP含量及ADP/ATP、AMP/ATP值比較與模型組比較，蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠ATP含量顯著降低，ADP/ATP、AMP/ATP比值均顯著升高（P＜0.05），且隨劑量增加效果越強，其中蒼耳亭高劑量組ATP含量顯著低于低、中劑量組（P＜0.05），ADP/ATP、AMP/ATP比值顯著高于低、中劑量組（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

2.5 各組大鼠肺癌組織MMP水平比較與模型組比較，蒼耳亭低、中、高劑量組肺癌組織MMP水平均明顯降低（P＜0.05），且隨著蒼耳亭劑量增加呈逐漸遞減趨勢，蒼耳亭高劑量組肺癌組織MMP水平低于低、中劑量組（P＜0.05）。見表4。JC-1熒光圖像結(jié)果顯示：模型組綠色熒光明顯減弱，紅色熒光明顯增強；蒼耳亭低、中、高劑量組綠色熒光逐漸增強，紅色熒光逐漸降低。結(jié)果見圖4。

圖3 各組大鼠肺癌細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，×200）Figure 3 Apoptosis of cancer cells between various groups of rats（by TUNEL staining，×200）

表2 各組大鼠肺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Table 2 Comparison of apoptosis index of lung cancer cells between various groups of rats（±s）

表2 各組大鼠肺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Table 2 Comparison of apoptosis index of lung cancer cells between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與蒼耳亭低劑量組比較；③P＜0.05，與蒼耳亭中劑量組比較

組別模型組蒼耳亭低劑量組蒼耳亭中劑量組蒼耳亭高劑量組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10凋亡指數(shù)（AI）/%2.4±0.8 5.6±1.2①14.7±2.5①②28.3±3.7①②③244.517＜0.001

2.6 各組大鼠肺癌組織中mTOR、p-4E-BP1蛋白表達(dá)比較與模型組比較，蒼耳亭低、中、高劑量組大鼠肺癌組織mTOR、p-4E-BP1蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），隨著蒼耳亭劑量增加呈逐漸遞減趨勢，且高劑量組降低最為顯著（P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

表3 各組大鼠肺癌組織三磷酸腺苷（ATP）含量及二磷酸腺苷（ADP）/ATP、一磷酸腺苷（AMP）/ATP比值比較Table 3 Comparison of ATP content and ADP/ATP and AMP/ATP ratios in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

表3 各組大鼠肺癌組織三磷酸腺苷（ATP）含量及二磷酸腺苷（ADP）/ATP、一磷酸腺苷（AMP）/ATP比值比較Table 3 Comparison of ATP content and ADP/ATP and AMP/ATP ratios in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與蒼耳亭低劑量組比較；③P＜0.05，與蒼耳亭中劑量組比較

組別模型組蒼耳亭低劑量組蒼耳亭中劑量組蒼耳亭高劑量組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 ADP/（ng·mg-1）293.4±28.7 425.1±37.2①458.3±36.4①②519.2±47.1①②③63.290＜0.001 ATP/（ng·mg-1）127.6±36.2 101.2±26.5①80.4±20.1①②65.7±12.4①②③14.537＜0.001 AMP/（ng·mg-1）319.1±32.5 323.8±29.2①369.8±30.1①②413.9±22.3①②③23.910＜0.001 ADP/ATP比值2.3±0.8 4.2±1.4①5.7±1.8①②7.9±2.1①②③15.393＜0.001 AMP/ATP比值2.5±0.9 3.2±1.1①4.6±1.5①②6.3±1.8①②③15.004＜0.001

表4 各組大鼠肺癌組織線粒體膜電位（MMP）水平比較Table 4 Comparison of MMP levels in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

表4 各組大鼠肺癌組織線粒體膜電位（MMP）水平比較Table 4 Comparison of MMP levels in lung cancer tissues between various groups of rats（±s）

①P＜0.05，與模型組比較；②P＜0.05，與蒼耳亭低劑量組比較；③P＜0.05，與蒼耳亭中劑量組比較

組別模型組蒼耳亭低劑量組蒼耳亭中劑量組蒼耳亭高劑量組F值P值鼠數(shù)/只10 10 10 10 MMP 431.2±50.6 187.5±41.3①87.9±36.2①②51.7±20.5①②③195.100＜0.001

3 討論

本研究以肺癌模型大鼠為研究對象，以蒼耳亭干預(yù)可顯著降低肺癌大鼠瘤體質(zhì)量和體積，改善肺癌組織病理形態(tài)，使癌巢消失，增加肺癌細(xì)胞凋亡指數(shù)，且隨著蒼耳亭濃度的增加，效果越顯著，提示蒼耳亭可有效抑制肺癌的生長。

氧化磷酸化是細(xì)胞能量代謝的主要途徑之一，腫瘤細(xì)胞在不斷增殖的過程中能生成大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphates，ATP），可為其持續(xù)生長提供能量[7]。因此，欲抑制腫瘤細(xì)胞的增殖可先抑制其能量的生成。ATP及其代謝產(chǎn)物二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的濃度是描述細(xì)胞代謝的主要參數(shù)，可直接反映機體能量代謝水平的高低[8]。本研究結(jié)果顯示，蒼耳亭可降低大鼠肺癌組織ATP的含量，增加肺組織ADP/ATP比值和AMP/ATP比值。ATP合成減少則腫瘤細(xì)胞能量代謝水平減弱，獲能減少，提示蒼耳亭可能通過抑制肺癌細(xì)胞能量代謝發(fā)揮抗肺癌作用。

圖4 各組JC-1熒光圖像比較（JC-1染色，×400）Figure 4 Comparison of JC-1 fluorescence images between various groups（by JC-1 staining，×400）

圖5 各組大鼠肺癌組織中mTOR、p-4E-BP1蛋白表達(dá)比較Figure 5 Comparison of mTOR and p-4E-BP1 protein expression in lung cancer tissues between various groups of rats

線粒體膜電位（MMP）的正常是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化的先決條件[9]。線粒體是由雙層膜包被的囊狀結(jié)構(gòu)，外膜有較高通透性，內(nèi)膜則通透性低，但這種不通透性對ATP的生成和MMP的維持起重要作用[10]。MMP是線粒體在氧化呼吸過程中內(nèi)膜兩側(cè)離子濃度不同所產(chǎn)生的跨膜電位差，MMP的穩(wěn)定有利于維持細(xì)胞的正常生理功能，MMP異常可導(dǎo)致線粒體膜的功能和狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響線粒體進(jìn)行氧化磷酸化，使細(xì)胞能量代謝異常[11-12]。本研究結(jié)果顯示，蒼耳亭能下調(diào)大鼠肺癌組織MMP，隨著蒼耳亭濃度的升高，MMP下降越顯著。MMP降低，則膜電位的電勢能降低，ATP的合成亦減少。提示蒼耳亭可通過降低MMP，減少肺癌細(xì)胞的ATP合成，從而抑制肺癌生長。

已有研究表明，蒼耳亭能通過誘導(dǎo)糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化失活引發(fā)細(xì)胞周期阻滯及凋亡[5]。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR/4E-BP1是GSK-3β上游的信號通路，激活其信號通路可介導(dǎo)細(xì)胞增殖，且與多種癌癥密切相關(guān)[13-14]。mTOR是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，激活狀態(tài)的mTOR可以磷酸化真核細(xì)胞下游的關(guān)鍵翻譯因子4E-BP1[15]。mTOR/4E-BP1通路調(diào)節(jié)功能的異常與人類惡性腫瘤的發(fā)展密不可分。當(dāng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)mTOR/4E-BP1被激活，可使腫瘤細(xì)胞增殖失控、凋亡抗拒，從而引起腫瘤細(xì)胞的代謝改變[16]。本研究結(jié)果顯示，蒼耳亭可下調(diào)大鼠肺癌組織mTOR和p-4E-BP1蛋白表達(dá)水平，且隨著蒼耳亭濃度的增加，其對mTOR和p-4E-BP1蛋白的抑制效果越顯著，表明蒼耳亭可通過抑制肺癌組織mTOR/4E-BP1信號通路的活化，起到抗肺癌的作用。

綜上所述，祛風(fēng)解表蒼耳子的主要活性成分蒼耳亭可通過降低癌細(xì)胞能量代謝，抑制癌細(xì)胞mTOR/4E-BP1信號通路的活化，抑制大鼠肺癌。