姚 軍，毛 慧，張 芹，趙國政，張晉華

(1.南京理工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京 210094；2.泰州市生態(tài)環(huán)境局，江蘇 泰州 225300；3.江蘇省泰州環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 泰州 225300；4.南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；5.山西師范大學(xué) 磁性分子與磁信息材料教育部重點(diǎn)實驗室，山西 臨汾 041004)

噻蟲啉(Thiacloprid)是在吡蟲啉基礎(chǔ)上，Bayer公司開發(fā)的具有廣譜、內(nèi)吸性新型煙堿類殺蟲劑[1，2]。噻蟲啉是目前優(yōu)良的殺蟲劑品種之一，其分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，在我國應(yīng)用廣泛，前景良好[3，4]。近年來，農(nóng)藥管理監(jiān)督力度不夠，農(nóng)藥過度濫用，導(dǎo)致所種植的農(nóng)作物藥害，環(huán)境被嚴(yán)重污染，食品中毒事件頻發(fā)[5-7]。因此，尋找快速準(zhǔn)確的噻蟲啉檢測技術(shù)是人們的迫切希望，研究意義重大[8，9]。

圖1 噻蟲啉的分子結(jié)構(gòu)

目前用于噻蟲啉殘留檢測的方法主要有高效液相色譜法[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)法[11]和固相萃取-高效液相色譜法[12]。但這些檢測方法對儀器的操作性要求較高，需要一定的專業(yè)技術(shù)背景，檢測時間較長，難以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測。以抗原/抗體作為生物識別物質(zhì)的納米電化學(xué)免疫傳感器，具有很好的選擇性、較多的種類、較低的測試費(fèi)用和適合聯(lián)機(jī)化的優(yōu)點(diǎn)，同時不受樣品顏色、濁度的影響，以及所需儀器設(shè)備相對簡單，具有簡便、快速、體積小的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個相關(guān)領(lǐng)域。目前，石墨烯優(yōu)異的電化學(xué)性能受到廣泛關(guān)注[13，14]，石墨烯復(fù)合物研究引起了新的熱潮[15-17]，由納米金修飾石墨烯的復(fù)合材料便是其中之一[18]。Yang等[19]利用納米金-石墨烯復(fù)合材料，檢測一種模型農(nóng)藥對氧磷，表現(xiàn)出較高的靈敏度、較低檢出限和較好穩(wěn)定性。Han等[20]利用納米金-石墨烯復(fù)合材料檢測癌胚抗原，線性范圍0.01～80 ng·mL-1，最低檢測限達(dá)到3.4 pg·mL-1。

本文建構(gòu)了納米金/石墨烯復(fù)合納米材料修飾電極的免疫傳感器，基于循環(huán)伏安法(Cyclic voltammetry，CV)表征了電極表面的電化學(xué)性質(zhì)，通過間接競爭法實現(xiàn)了體系中噻蟲啉的高靈敏檢測，并對香蕉、西紅柿、蘋果和大米實際樣品進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI852C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)；噻蟲啉(Sigma-Aldrich公司)；殼聚糖(Sigma-Aldrich公司)；噻蟲啉抗體(南京曉莊學(xué)院生物化工與環(huán)境工程學(xué)院)；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA，南京生興生物技術(shù)有限公司)；磷酸緩沖溶液(Phosphate buffer solution，PBS，ThermoFisher公司)。試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 免疫傳感器的制備

噻蟲啉溶液的制備:準(zhǔn)確稱取0.05 g噻蟲啉，溶于10 mL N，N-二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)中，配得0.5 mg·mL-1噻蟲啉溶液。蒸餾水對上述標(biāo)準(zhǔn)液稀釋，得到0.2 mg·mL-1噻蟲啉溶液。

石墨烯分散液的制備:準(zhǔn)確稱取0.05 g石墨烯[21]，溶于2 mL蒸餾水，超聲分散得石墨烯分散液。

玻碳電極(Glassy carbon electrode，GCE)的處理:將電極依次在直徑為0.3μm和0.05μm的Al2O3拋光粉上打磨，分別在無水乙醇-蒸餾水、蒸餾水中各超聲清洗5 min，蒸餾水沖洗，在2 mM K3Fe(CN)6中掃CV圖，以電勢差在100 mV以內(nèi)為標(biāo)準(zhǔn)，衡量電極是否打磨完好。將打磨好的電極放在室溫下，晾干。

通過電化學(xué)沉積將納米金修飾在玻碳電極上，再將4μL石墨烯分散液滴涂于電極上，最后將2μL濃度為0.2 mg·mL-1的噻蟲啉溶液滴涂于電極表面，40℃烘干。修飾過的電極浸泡在5%的BSA溶液中，37℃烘箱中孵育30 min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)。

1.3 香蕉/西紅柿/蘋果樣品的前處理

稱取2±0.005 0 g香蕉/西紅柿/蘋果于10 mL樣品管中，加入噻蟲啉溶液和3 mL乙腈，超聲30 min，離心10 min(2 000 r·m-1)，將上清液轉(zhuǎn)移至樣品管，50℃氮?dú)獯蹈?，? mL pH=7.4的PBS加入樣品管，溶解濃縮物。

1.4 大米樣品的前處理

稱取1±0.005 0 g大米于10 mL樣品管，加入噻蟲啉溶液，2 mL蒸餾水浸泡15 min，再加入2 mL乙腈，超聲30min，離心10min(2 000 r·m-1)，將上清液轉(zhuǎn)移至樣品管，50℃氮?dú)獯蹈桑? mL pH=7.4的PBS加入樣品管，溶解濃縮物。

1.5 電化學(xué)檢測

工作電極、參比電極與輔助電極分別為納米金/石墨烯/噻蟲啉修飾的玻碳電極、Ag/AgCl電極與鉑絲電極，通過CV研究不同修飾電極的電化學(xué)行為，運(yùn)用差分脈沖伏安法(Differential pulse voltammetry，DPV)對殺蟲劑噻蟲啉進(jìn)行電化學(xué)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 免疫傳感器檢測噻蟲啉的原理

納米金/石墨烯修飾電極的免疫傳感器檢測噻蟲啉的原理如圖2所示。(1)納米金/石墨烯/噻蟲啉電極浸入噻蟲啉抗體和游離噻蟲啉的孵育液時，固定在電極上的噻蟲啉、溶液中游離的噻蟲啉分別競爭結(jié)合噻蟲啉抗體；(2)噻蟲啉和噻蟲啉抗體之間存在特定的競爭反應(yīng)，從而使抗體在電極上發(fā)生吸附；(3)所形成的抗體-抗原復(fù)合物致使電極產(chǎn)生位阻，降低峰值電流?；陔娀瘜W(xué)信號的差異，實現(xiàn)噻蟲啉的定量檢測。

2.2 試驗條件的優(yōu)化

孵育時間的優(yōu)化由DPV確定。首先，用一定體積的抗體依次孵育0、10、15、20、25和30 min。納米金/石墨烯/噻蟲啉電極的DPV峰電流隨孵育時間的變化趨勢，如圖3(a)所示，前25 min電流值快速下降，到25～30 min電流值增加。所以，選擇25 min作為免疫反應(yīng)時間為宜。

圖2 納米金/石墨烯修飾電極的免疫傳感器檢測噻蟲啉的原理

孵育溶液中噻蟲啉抗體含量的優(yōu)化由DPV確定。在不同抗體濃度的50μL溶液中，浸入納米金/石墨烯/噻蟲啉電極，孵育25 min，如圖3(b)所示。噻蟲啉抗體含量從0μL變化至10μL時，DPV峰值電流明顯降低。噻蟲啉抗體體積從10μL增至20μL時，峰值電流變化不大，表示電極上的結(jié)合位點(diǎn)基本達(dá)到飽和。因此，選擇10μL作為反應(yīng)中抗體體積。

圖3 孵育時間和抗體含量與DPV峰值電流關(guān)系圖

2.3 免疫傳感器的循環(huán)伏安分析

不同階段修飾電極的CV曲線如圖4所示。裸電極a的CV曲線存在一對明顯的氧化還原峰。修飾了納米金/石墨烯/噻蟲啉之后的電極b，由于石墨烯優(yōu)異的電化學(xué)活性，CV峰值電流顯著增大，電子傳遞明顯增強(qiáng)。放入孵育液之后的電極c，由于特異性免疫反應(yīng)，電子傳遞受到阻礙，CV峰值電流下降，表明噻蟲啉已修飾到電極上。

圖4 不同修飾電極在2 mM K3[Fe(CN)6]PBS溶液中的CV曲線

2.4 噻蟲啉的檢測

孵育液中游離的噻蟲啉、固定在電極表面的噻蟲啉競爭分別與溶液中噻蟲啉抗體反應(yīng)，如圖5所示，孵育液濃度分別為(a)5 000 ng·mL-1；(b)4 000 ng·mL-1；(c)3 000 ng·mL-1；(d)2 000 ng·mL-1；(e)1 000 ng·mL-1；(f)500 ng·mL-1；(g)100 ng·mL-1；(h)50 ng·mL-1；(i)10 ng·mL-1。從圖5可看出，孵育液中，噻蟲啉濃度的增加，導(dǎo)致DPV峰值電流逐漸增加。定義在僅含5μL抗體的PBS溶液中，納米金/石墨烯/噻蟲啉電極的響應(yīng)電流為I0，在含有游離噻蟲啉的孵育液中，電極的響應(yīng)電流為I x，響應(yīng)電流的差值ΔI與噻蟲啉濃度在10～5 000 ng·mL-1范圍內(nèi)成正比，檢出限為0.7 ng·mL-1，低于文獻(xiàn)中超高效液相色譜法對噻蟲啉的殘留檢測[22]。

圖5 不同濃度孵育液中，納米金/石墨烯/噻蟲啉電極的DPV曲線

2.5 重復(fù)性與穩(wěn)定性

對納米金/石墨烯/噻蟲啉修飾電極進(jìn)行5次DPV掃描，峰值電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.5%，表明修飾電極重復(fù)性較好。

將納米金/石墨烯/噻蟲啉電極存放在空氣中，每隔一天進(jìn)行DPV掃描，峰值電流的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.5%，表明修飾電極穩(wěn)定性較好。

2.6 香蕉樣品的分析

對3種加入不同量噻蟲啉溶液的香蕉樣品進(jìn)行DPV測定，平行測定3次，見表1。如表1所示，噻蟲啉的回收率在88.2%～101.1%之間，平均為95.0%。

表1 香蕉樣品加標(biāo)處理檢測噻蟲啉試驗結(jié)果

2.7 西紅柿樣品的分析

對3種加入不同量噻蟲啉溶液的西紅柿樣品進(jìn)行DPV測定，平行測定3次，見表2。如表2所示，噻蟲啉的回收率在95.8%～98.6%之間，平均為97.1%。

表2 西紅柿樣品加標(biāo)處理檢測噻蟲啉試驗結(jié)果

2.8 蘋果樣品的分析

對3種加入不同量噻蟲啉溶液的蘋果樣品進(jìn)行試驗前處理并測定，每個濃度測定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，噻蟲啉的回收率在87.1%～113.4%之間，平均為102.9%，統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3 蘋果樣品加標(biāo)處理檢測噻蟲啉試驗結(jié)果

2.9 大米樣品的分析

對3種加入不同量噻蟲啉溶液的大米樣品進(jìn)行DPV測定，平行測定3次，見表4。如表4所示，噻蟲啉的回收率在92.8%～103.2%之間，平均為98.5%。

表4 大米樣品加標(biāo)處理檢測噻蟲啉試驗結(jié)果

3 結(jié)束語

本文構(gòu)建了一種新型納米金/石墨烯/噻蟲啉電化學(xué)免疫傳感器檢測噻蟲啉，結(jié)合石墨烯優(yōu)異的導(dǎo)電性能，以及納米金優(yōu)良的導(dǎo)電性能和生物相容性，使納米金、石墨烯與噻蟲啉抗原共同固定于玻碳電極上檢測噻蟲啉。響應(yīng)電流的增加ΔI與噻蟲啉濃度在10～5 000 ng·mL-1范圍內(nèi)成正比，檢出限為0.7 ng·mL-1。這一新型免疫傳感器具有較好的重復(fù)性、穩(wěn)定性，將其應(yīng)用于香蕉、西紅柿、蘋果與大米等實際樣品的檢測，取得了滿意的結(jié)果。