楊新宇 韓雨薇 陳立剛 李佳朔 潘鵬宇 梁國標(biāo)

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是一類病死率較高的顱內(nèi)出血性疾病，病死率高達(dá)50%，出血后早期腦損傷（early brain injury，EBI）是重要的死亡原因之一[1]。氧化應(yīng)激是EBI 的重要的病理機(jī)制，導(dǎo)致抗氧化成分的減少以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加[2]，造成神經(jīng)元凋亡，與SAH癥狀和預(yù)后直接相關(guān)[2]。據(jù)報(bào)道，cAMP/PKA 信號通路夠參與抑制氧化應(yīng)激的過程，抑制腦組織炎癥反應(yīng)過程[3，4]。矢車菊素，又名花青素，具有抗氧化、抗炎等作用[5，6]。矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-Oglucoside，C3G）是矢車菊素家族中最常見的一種[7]。據(jù)報(bào)道，C3G 對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[8]；而且，C3G 能通過cAMP/PKA 信號通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[3]。本文探討C3G 對小鼠SAH 后EBI 的影響及PKA/CREB信號通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組 取72 只4～6 周齡、體重28～32 g的清潔級雄性c57鼠[長生生物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2020-0001]，隨機(jī)分為假手術(shù)組、SAH 組、溶劑組、低劑量（10 mg/kg）C3G 組、中劑量（20 mg/kg）C3G 組、高劑量（30 mg/kg）C3G組。

1.2 SAH 模型制作 應(yīng)用頸動脈穿刺法制作小鼠SAH 模型[9]。腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，取頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈與頸外動脈。夾閉頸總動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端根部。在頸總動脈分叉處上部穿入長1.5 cm、直徑0.625 mm 的尼龍線，打開頸內(nèi)動脈，并將尼龍線穿入，推進(jìn)約10 mm 后，刺破頸內(nèi)動脈/后交通動脈分叉附近的Willis 環(huán)，會有輕微落空感，小鼠呼吸節(jié)律會改變，然后取出尼龍線，結(jié)扎頸外動脈，開放頸總動脈，縫合切口。假手術(shù)組進(jìn)行同樣的操作，但不刺破血管。

1.3 藥物干預(yù)及取材SAH后30 min，腹腔注射C3G，濃度分別為10、20、30 mg/kg[10，11]。溶劑組注射等體積生理鹽水。SAH 后24 h，進(jìn)行Garcia 和平衡木實(shí)驗(yàn)；然后，每組隨機(jī)取6只小鼠取外周血進(jìn)行活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量檢測，再取出完整腦組織進(jìn)行SAH出血量評分，立即稱重檢測腦水含量；每組剩余6 只取外周血進(jìn)行還原型谷胱苷肽和氧化型谷胱苷肽比值（GSH/GSSG）檢測后，脫頸處死取出腦組織進(jìn)行免疫印跡法檢測。

1.4 Garcia評分 按文獻(xiàn)[12]報(bào)道方法進(jìn)行評分，總分2～15 分，分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能越好。首先，觀察小鼠在籠子內(nèi)自發(fā)活動5 min，評分標(biāo)準(zhǔn)為無活動（0分），有活動、僅有位置變化（1分），有活動但接觸籠子四個邊緣少于3 個（2 分），有活動、接觸籠子四個邊緣（3分）；其次，觀察四肢活動左右對稱性，一側(cè)肢體無活動（0 分），一側(cè)肢體輕度活動（1 分），一側(cè)肢體活動緩慢（2分），雙側(cè)對稱，與SAH前期無明顯差別（3分）；第三，提起尾巴觀察四肢活動左右對稱性，一側(cè)肢體無活動、肢體無外展（0分），一側(cè)肢體輕微活動和外展（1 分），肢體有活動、比另一側(cè)稍弱（2分），雙側(cè)肢體活動基本對稱、與SAH 前無明顯差異（3 分）；第四，觀察爬網(wǎng)能力，不能攀爬（1 分），一側(cè)肢體稍弱（2分），爬網(wǎng)能力正常、與SAH前無明顯差異（3 分）；第五，觸碰一側(cè)身體反應(yīng)評分，無反應(yīng)（1分），一側(cè)反應(yīng)稍弱（2分），雙側(cè)對稱（3分）。

1.5 平衡木實(shí)驗(yàn)評分 取平衡木器材，實(shí)驗(yàn)前小鼠在兩邊平板上分別放置10 s，然后把小鼠放在橫木中間，觀察40 s 移動情況：0～1 分，沒有移動、跌落；2分，移動22 cm且停留置至少25 s；3分，移動超過22 cm 且停留至少25 s；4 分，到達(dá)平板或25 s 內(nèi)走完一半的距離沒爬上平板；5分，25 s內(nèi)到達(dá)平板。

1.6 出血量評分 參照文獻(xiàn)[12]報(bào)道方法進(jìn)行出血量評分。將基底池分為6 段，每段根據(jù)血凝塊數(shù)量分為0～3 級：0 級為無血凝塊，1 級為極少血凝塊，2 級為中度血凝塊、但動脈可識別，3 級為掩蓋該段內(nèi)的所有動脈。SAH出血分級的最終評分為六個部位之和：0～7分為輕度出血，8～12分為中度出血，13～18為重度出血。排除評分小于8 分的小鼠，將中度和重度出血小鼠選為SAH模型。

1.7 干濕重法檢測腦水含量 術(shù)后24 h 脊椎脫臼法處死小鼠，取腦組織稱重（濕重），在100 ℃下烘干至腦組織重量不再改變（干重）。腦含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.8 外周血ROS 和MDA 含量檢測 用毛細(xì)采血管采取小鼠眼球靜脈血，4 ℃下10 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，抽取血清待測。用ROS 試劑盒和MDA 試劑盒按照說明書進(jìn)行測定ROS和MDA。

1.9 GSH/GSSG 比值檢測 選用標(biāo)準(zhǔn)GSH/GSSG 試劑盒按照說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作。

1.10 免疫印跡法檢測 小鼠脫頸處死后取出血側(cè)腦組織，檢測PKA、CREB、GCLC、p-PKA、p-CREB表達(dá)水平。先將腦組織研磨后加入RIPA裂解液，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，靜置裂解30 min 后，4 ℃下12 000 轉(zhuǎn)/min 離心10 min，取上清液待測。使用BCA 試劑盒進(jìn)行定量，先將蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行電泳分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜。BSA 封閉后，應(yīng)用一抗和二抗孵育，使用BeyoECL 發(fā)光溶液進(jìn)行曝光。β-actin為內(nèi)參，使用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism v9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析；P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C3G 對小鼠SAH 后神經(jīng)功能的影響 與假手術(shù)組相比，SAH 組Garcia 評分和平衡木實(shí)驗(yàn)評分均明顯降低（P＜0.05；圖1）；C3G 明顯增加Garcia 評分和平衡木實(shí)驗(yàn)評分（P＜0.05；圖1），且以中劑量C3G 作用最明顯（P＜0.05；圖1）。因此，選取20 mg/kg 為最適劑量進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 C3G對小鼠SAH后神經(jīng)功能的影響

2.2 C3G對小鼠SAH后腦含水量和出血量評分的影響 與假手術(shù)組相比，SAH 組腦含水量明顯增加、出血量評分明顯增高（P＜0.05；圖2）。C3G明顯減輕腦含水量、降低出血量評分（P＜0.05；圖2）。

圖2 C3G對小鼠SAH后腦含水量和出血量評分的影響

2.3 C3G對小鼠SAH后外周血氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響與假手術(shù)組比較，SAH 組外周血ROS、MDA 含量明顯增高（P＜0.05；圖3），而GSH/GSSG 比值明顯降低（P＜0.05；圖3）。C3G 明顯降低外周血ROS、MDA 含量（P＜0.05；圖3），明顯增加GSH/GSSG 比值（P＜0.05；圖3）。

圖3 C3G對小鼠SAH后外周血氧化應(yīng)激產(chǎn)物的影響

2.4 C3G 對小鼠SAH 腦組織PKA/CREB 信號通路的影響 與假手術(shù)組比較，SAH 組p-PKA、p-CREB 和GCLC 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05；圖4），而PKA、CREB 表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05；圖4）。C3G 明顯增加SAH 后腦組織p-PKA、p-CREB、GCLC 表達(dá)水平（P＜0.05；圖4），而對PKA、CREB 表達(dá)水平無明顯影響（P＞0.05；圖4）。

3 討論

本文結(jié)果顯示，C3G 可能通過激活PKA 信號通路，減輕氧化應(yīng)激損傷，改善小鼠SAH 后EBI。EBI為SAH后72 h內(nèi)發(fā)生的一系列病理反應(yīng)，為SAH死亡的主要原因[1，12]。EBI 損傷機(jī)制包括微循環(huán)衰竭、微血栓形成、離子穩(wěn)態(tài)改變、興奮性中毒、血腦屏障破壞、炎癥和氧化級聯(lián)反應(yīng)、基質(zhì)金屬蛋白酶上調(diào)等，共同參與SAH后細(xì)胞死亡，最終功能障礙[1]。氧化應(yīng)激損傷是其中至關(guān)重要的機(jī)制，發(fā)病72 h內(nèi)，抗氧化成分的減少、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的急劇增加，與不良預(yù)后密切相關(guān)[1]。

抗氧化劑或者阻斷氧化應(yīng)激反應(yīng)的藥物有助于減輕氧化應(yīng)激損傷。C3G是花青素家族中最常見的一種抗氧化性強(qiáng)的成分[14]。C3G可以減輕體外培養(yǎng)的神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，顯著提高細(xì)胞活力和減少細(xì)胞凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)C3G可能是通過保護(hù)線粒體GSH 發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用[16，17]。C3G也可能是由其他物質(zhì)介導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用。首先C3G在生理pH值下不穩(wěn)定，可以被降解成原兒茶酸和氰化物等物質(zhì)，這兩種代謝產(chǎn)物都能抑制H2O2誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和DNA 片段化；其次，C3G 被吸收后，主要被結(jié)合到細(xì)胞膜上，因此，C3G 的作用還需要其他物質(zhì)介導(dǎo)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠SAH 后腦水腫加劇，外周血ROS 和MDA 含量明顯增加，神經(jīng)功能嚴(yán)重受損；而C3G明顯減輕腦水腫，降低ROS和MDA 水平，增加GSH、p-PKA 和p-CREB，GSH 生成的關(guān)鍵酶GCLC 也明顯上調(diào)。這提示C3G可能是通過激活PKA 通路，上調(diào)GCLC，促進(jìn)GSH 生成，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

研究表明，減輕或抑制氧化應(yīng)激，可減輕SAH后EBI[19]。SAH后，作為血液成分之一的氧合血紅蛋白自身會產(chǎn)生ROS，線粒體和酶也會促進(jìn)ROS 的生成，內(nèi)源性抗氧化保護(hù)系統(tǒng)受到抑制，氧化應(yīng)激顯著加重[20]。哺乳動物依賴GSH的抗氧化系統(tǒng)在細(xì)胞防御活性氧的過程中起重要作用，cAMP/PKA 信號通路可以促進(jìn)GSH 的生成。C3G 明顯促進(jìn)PKA 磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)CREB 磷酸化，誘導(dǎo)GCLC 表達(dá)，促進(jìn)GSH的生成，起抗氧化作用[21]。

本研究尚有不足之處。在SAH 模型制作中，每只小鼠的SAH 評分并不一致，這可能會影響小鼠的各類指標(biāo)，目前缺少更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑u價(jià)指標(biāo)。此外，EBI的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，還包括炎癥反應(yīng)等多種病理反應(yīng)[22]，氧化應(yīng)激的過程也是多種病理機(jī)制構(gòu)成，涉及到多種因子之間的反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)僅針對C3G對于ROS 和MDA 的變化進(jìn)行驗(yàn)證，GSH/GSSG、p-PKA，p-CREB 和GCLC 的增加雖然提示了C3G 可能的作用通路，但C3G 是否與其它因子間存在相互作用尚不清楚。因此，C3G 對于EBI 是如何發(fā)揮作用的還需要進(jìn)一步研究。

總之，C3G 能減輕小鼠SAH 后EBI，改善小鼠神經(jīng)功能，其機(jī)制肯能是激活PKA 信號通路，上調(diào)GCLC 表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕氧化應(yīng)激損傷。