牟大超，吳沙沙，周 軼

(四川大學(xué)華西醫(yī)院人類疾病和免疫治療研究室，四川 成都 610041)

外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，PBMC被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在天然免疫方面，通過(guò)分離PBMC能分化誘導(dǎo)出不同類型的樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)，DC在抗原識(shí)別和遞呈方面的研究較為廣泛[1]。在體液免疫方面，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可分選出B淋巴細(xì)胞，該細(xì)胞對(duì)于全人源抗體的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有重要意義。在細(xì)胞免疫方面，分離PBMC用于研究T淋巴細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子水平能反映疾病發(fā)展程度[2-3]。此外，在生物治療領(lǐng)域，如嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法等也離不開(kāi)較好的PBMC分離方法[4-5]。

PBMC的分離方法有較為經(jīng)典的Ficoll密度離心法、Percoll離心法和羥乙基淀粉(hydroxyethyl starch，HES)沉降法等[6-9]，根據(jù)樣本類型和PBMC的后續(xù)應(yīng)用可選擇不同的分離方法。本研究采用Ficoll離心法、HES沉降法和先HES沉降再Ficoll離心(HES+Ficoll)3種方法來(lái)分離相同樣本的PBMC，以探討不同分離方法對(duì)所得細(xì)胞后續(xù)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年5月，選擇四川大學(xué)華西醫(yī)院人類疾病和免疫治療研究室6位體檢健康的工作人員為受試對(duì)象，采集每位受試者外周血15 mL。受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)自身免疫性疾病、腫瘤、病毒和細(xì)菌感染等。本研究通過(guò)四川大學(xué)華西醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查[2019年審(332)號(hào)],每位受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京Solarbio公司，HES購(gòu)自加拿大Stemcell公司，1640高糖培養(yǎng)基和青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自阿根廷Natocor公司，CD3流式抗體、CD4流式抗體和CD8流式抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PBMC分離將15 mL外周血平均分為3份，分別采用Ficoll離心法、HES沉降法和HES+Ficoll 法進(jìn)行分離。Ficoll離心法：用等體積1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋后，加入預(yù)先加了3 mL外周血淋巴細(xì)胞分離液的分離管中，平角離心機(jī)中800×g(離心機(jī)加速度和減速度調(diào)至最低)22 ℃離心15 min，取中間白膜層用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次，所得細(xì)胞沉淀即為PBMC。HES沉降法：60 g·L-1的HES水溶液以51稀釋混勻后在37 ℃孵箱中靜置30 min，取上層澄清液體，離心得細(xì)胞沉淀，再用PBS洗滌2次，所得細(xì)胞沉淀即為PBMC。HES+Ficoll法：先用HES法得到細(xì)胞沉淀，再用外周血淋巴細(xì)胞分離液對(duì)其進(jìn)行密度梯度離心，所得沉淀即為PBMC。分別用顯微鏡和細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)3種方法得到的PBMC細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察和計(jì)數(shù)。

1.3.2 PBMC凍存采用每1×106個(gè)細(xì)胞加入1 mL 凍存液的體系進(jìn)行細(xì)胞凍存，凍存液為含體積分?jǐn)?shù)10%二甲基亞砜的胎牛血清，加入凍存液的細(xì)胞放入細(xì)胞凍存管，再放入程序降溫盒，-80 ℃凍存過(guò)夜后轉(zhuǎn)出，于-80 ℃長(zhǎng)期凍存。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞將3種分離方法得到的凍存前后PBMC(凍存后細(xì)胞于37 ℃水浴復(fù)蘇)用熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)(fluorescence actirated cell sorting,FACS)buffer洗1遍后進(jìn)行FVS780染色，然后用含體積分?jǐn)?shù)1%新生牛血清的PBS溶液洗滌細(xì)胞2遍，進(jìn)行CD3、CD4和CD8抗體染色，抗體稀釋度均為1100，室溫避光孵育 30 min，洗滌后于200 μL PBS中重懸，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。根據(jù)前向散射光(forward scatter,FSC)和側(cè)向散射光(side scatter,SSC)確定淋巴細(xì)胞群，并計(jì)算PBMC中淋巴細(xì)胞所占比例、淋巴細(xì)胞中活細(xì)胞(FVS780熒光強(qiáng)度小于1×102為活細(xì)胞)所占比例(細(xì)胞存活率)和活細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞數(shù)量與CD8+T細(xì)胞數(shù)量的比值(CD4+T/CD8+T)。

2 結(jié)果

2.1 3種分離方法得到的PBMC的形態(tài)和計(jì)數(shù)結(jié)果比較3種分離方法得到的PBMC形態(tài)均一致(圖1)，相比于另外2種方法，用HES沉降法分離得到的PBMC除淋巴細(xì)胞外還有部分紅細(xì)胞。

A:Ficoll離心法；B：HES沉降法；C：Ficoll+HES法。

細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,Ficoll離心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC數(shù)量分別為(2.50±0.27)×109、(5.75±1.64)×109、(8.98±0.81)×108L-1，HES沉降法所得PBMC數(shù)量顯著多于Ficoll離心法和Ficoll+HES法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);Ficoll離心法所得PBMC數(shù)量高于Ficoll+HES法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3種分離方法得到的PBMC凍存前后流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果比較結(jié)果見(jiàn)表1。凍存前，F(xiàn)icoll離心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC中淋巴細(xì)胞存活率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HES沉降法得到的PBMC中淋巴細(xì)胞比例顯著低于Ficoll離心法和HES+Ficoll法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ficoll離心法和HES+Ficoll法所得到的PBMC中淋巴細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ficoll離心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的存活細(xì)胞中CD4+T/CD8+T比值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3種分離方法得到的PBMC凍存前后流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果比較

凍存6個(gè)月后，F(xiàn)icoll離心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC中淋巴細(xì)胞存活率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HES沉降法得到的PBMC中淋巴細(xì)胞比例顯著低于Ficoll離心法和HES+Ficoll法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ficoll離心法和HES+Ficoll法所得到的PBMC中淋巴細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ficoll離心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的存活細(xì)胞中CD4+T/CD8+T比值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3種方法分離得到的PBMC凍存后淋巴細(xì)胞存活率均低于凍存前，PBMC中淋巴細(xì)胞比例高于凍存前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；存活細(xì)胞中CD4+T/CD8+T比值與凍存前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

PBMC的分離已成為細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)，特別是流式細(xì)胞術(shù)分析和分選細(xì)胞的必備技術(shù)手段[10-11]。目前常用的分離方法有Ficoll分離法、Percoll密度梯度離心和HES沉降法等。Ficoll和Percoll分離法均為密度梯度原理[12]，將樣本中不同大小細(xì)胞進(jìn)行分離，相對(duì)來(lái)說(shuō)Ficoll分離法成本更低，常見(jiàn)于實(shí)驗(yàn)室中對(duì)外周血樣本的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離，但需要依賴高速離心條件，對(duì)儀器和技術(shù)人員依賴較大。HES沉降法主要利用其能與紅細(xì)胞所帶的負(fù)電荷相結(jié)合，使紅細(xì)胞凹面相貼，從而加速紅細(xì)胞的沉降，分離出上層白細(xì)胞[13]，對(duì)硬件和技術(shù)人員要求不高，可用于病房、診所及事故發(fā)生地血樣的及時(shí)處理，并用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

臨床來(lái)源的樣本以外周血為主，當(dāng)前流式細(xì)胞術(shù)是分析免疫細(xì)胞亞群最常用的手段，故本研究主要評(píng)價(jià)3種分離方法得到的PBMC對(duì)后續(xù)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果的影響，以驗(yàn)證更為簡(jiǎn)便的HES分離方法替代傳統(tǒng)Ficoll離心法的可行性。同一樣本以Ficill離心法分離PBMC時(shí)，細(xì)胞較為均一，極少有紅細(xì)胞混雜；使用HES沉降法進(jìn)行分離時(shí)，所得細(xì)胞數(shù)量最多，但顯微鏡檢查結(jié)果顯示細(xì)胞不純，含有部分紅細(xì)胞；先HES沉降再進(jìn)行Ficoll離心雖然細(xì)胞也較純，但收獲細(xì)胞數(shù)量受到影響。在對(duì)3種方法獲得的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是新鮮分離的PBMC還是凍存后的PBMC，其中的淋巴細(xì)胞存活率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；雖然使用Ficoll離心法所得的PBMC中淋巴細(xì)胞比例最高，HES沉降法所得的PBMC中淋巴細(xì)胞比例最低，但從能反應(yīng)機(jī)體免疫功能的指標(biāo)CD4+T/CD8+T比值來(lái)看，3種分離方法所得結(jié)果比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明3種分離方法均能反映樣本的真實(shí)情況。使用HES法所得的淋巴細(xì)胞比例不高可能與其樣本中摻雜了紅細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞總量大有關(guān)。與凍存前相比，PBMC凍存后淋巴細(xì)胞存活率略有下降，但3種分離方法的淋巴細(xì)胞存活率仍高于75%，在可接受范圍內(nèi)。凍存后淋巴細(xì)胞中CD4+T/CD8+T比值與凍存前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)PBMC凍存的可行性。有研究顯示，HES分離方法還能用于稀有樣本或少量樣本的分離，如臍帶血、骨髓等，但影響HES分離效率的因素較多，如HES濃度、HES與樣本體積比例、沉降距離等[7,14]，因此針對(duì)具體樣本，仍需對(duì)該方法進(jìn)一步優(yōu)化，形成針對(duì)特定樣本的標(biāo)準(zhǔn)化分離流程。

綜上所述，從分離所得細(xì)胞數(shù)量和純度以及免疫細(xì)胞亞群來(lái)看，HES沉降法分離得到的PBMC可用于后續(xù)FACS分析，在條件有限的實(shí)驗(yàn)室可替代傳統(tǒng)Ficoll分離法用于 PBMC的分離。