王芊，張博文，羅鵬，郭建勛，王宏剛，聶井君，王任先，陳大福

·論著·

骨肉瘤干細(xì)胞差異表達(dá)microRNA對(duì)其干性特性的影響

王芊，張博文，羅鵬，郭建勛，王宏剛，聶井君，王任先，陳大福

探討骨肉瘤干細(xì)胞差異表達(dá) microRNA（miRNA）及其對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的干性特性（自我更新、侵襲、凋亡）的影響。采用無血清懸浮培養(yǎng)法和流式分選術(shù)分離鑒定骨肉瘤干細(xì)胞；分別采用成球?qū)嶒?yàn)、體外侵襲鑒定骨肉瘤干細(xì)胞的干性特性；高通量測(cè)序檢測(cè)骨肉瘤干細(xì)胞中差異表達(dá) miRNA；采用定量逆轉(zhuǎn)錄 PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)差異表達(dá) miRNA 的情況，驗(yàn)證 miRNA 結(jié)果；相關(guān) miRNA 抑制劑干擾后，分別進(jìn)行成球?qū)嶒?yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miRNA 對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞自我更新、侵襲能力和細(xì)胞凋亡的影響。成功分離 Saos-2 的 CD133+和 CD133-細(xì)胞，具有較強(qiáng)的自我更新能力和侵襲能力。與 CD133-細(xì)胞相比，CD133+細(xì)胞的高表達(dá) miRNAs 共有 15 個(gè)；低表達(dá) miRNAs 共有 2 個(gè)。采用 qPCR 技術(shù)驗(yàn)證高通量測(cè)序差異表達(dá) miRNA 相關(guān)結(jié)果，CD133+亞群中 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表達(dá)上調(diào)，miR-3143、miR-3150a-5p表達(dá)下調(diào)。抑制相關(guān)高表達(dá) miRNA（miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091）表達(dá)后，CD133+細(xì)胞的自我更新能力和侵襲均下降，細(xì)胞凋亡上升。骨肉瘤干細(xì)胞中具有多種差異表達(dá) miRNA，其對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞的干性特性具有調(diào)控作用。

骨肉瘤干細(xì)胞； CD133； 自我更新； 侵襲

骨肉瘤是骨科常見的惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，骨肉瘤具有明顯的轉(zhuǎn)移特性。一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，則預(yù)后很差，其 5 年平均的生存率為 20% ～ 30%[1-2]。目前對(duì)于影響骨肉瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不明確。因此，降低骨肉瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，探究復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的機(jī)制非常重要。

骨肉瘤干細(xì)胞（osteosarcoma stem cells，OSCs）是指骨肉瘤中存在一少部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群。2005 年，Gibbs 等[3]首次報(bào)道了一小部分具有自我更新能力，并能在無血清懸浮培養(yǎng)條件下形成腫瘤細(xì)胞球的細(xì)胞，這部分細(xì)胞高表達(dá) STAT3 和多潛能干細(xì)胞標(biāo)記 Oct3/4、Nanog，顯示出干細(xì)胞樣的特性[4-6]。國內(nèi)外研究者通過側(cè)群細(xì)胞法、無血清懸浮培養(yǎng)、表面標(biāo)志物分選等多種途徑成功分離了 OSCs。此外，OSCs 表面標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，如CD133、CD117、CD271、Stro-1 等[7-9]，這些表面標(biāo)志物對(duì)于骨肉瘤干細(xì)胞的分離鑒定至關(guān)重要。骨肉瘤干細(xì)胞表型功能和分子機(jī)制的不斷深入研究，為骨肉瘤的靶向治療提供了新策略。

microRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的非編碼單鏈 RAN 分子（平均長度 22 個(gè)核苷酸），參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[10-11]。大量研究表明，miRNA 在多種 OSCs 中表達(dá)異常，對(duì) OSCs 的自我更新、侵襲遷移、耐藥等特性具有重要的調(diào)控作用[12-13]。本研究重點(diǎn)探討骨肉瘤 CD133+細(xì)胞亞群差異表達(dá)的 miRNA，并進(jìn)一步研究這些 miRNA 對(duì)骨肉瘤 CD133+細(xì)胞亞群生物學(xué)特性的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 骨肉瘤細(xì)胞系 Saos-2 購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫；B27、bFGF、EGF、Mccoy's 5A 和 FBS 均購自美國 Gibco 公司；抗人 PE-CD133 抗體購自德國美天旎公司；miRNA isolation kit 購自美國 Ambion 公司；miRNA 抑制劑購自 Ribobio 公司；Matrigel 購自美國 Corning 公司；lipofectamine 3000 購自美國 Invitrogen 公司。

1.1.2 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和流式細(xì)胞儀均為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；倒置相差顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品；ABI7500 熒光定量 PCR 為美國 Applied Biosystems 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 骨肉瘤細(xì)胞的成球培養(yǎng) 采用含 10% 胎牛血清的 Mccoy's 5A 培養(yǎng)基，在 37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，將對(duì)數(shù)生長期的 Saos-2 細(xì)胞用胰酶消化至單個(gè)細(xì)胞，制備成細(xì)胞密度為 2 × 104/ml 的細(xì)胞懸液，接種于含 B27（1:50）、bFGF（20 ng/ml）和 EGF（20 ng/ml）的 DMFM/F12 無血清培養(yǎng)基中，Saos-2 經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng) 11 d 可形成緊實(shí)的細(xì)胞球體，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析及分選 Saos-2 的 CD133+細(xì)胞 消化對(duì)數(shù)期的 Saos-2 單細(xì)胞懸液，1200 r/min離心5 min 后用 PBS 洗 1 遍，加入 PE-CD133 以 1:50 比例稀釋抗體細(xì)胞，重懸細(xì)胞濃度至 1 × 107/ml，37 ℃避光孵育 30 min，PBS 洗 2 遍，用 PBS 重懸，上機(jī)行流式細(xì)胞儀分析及分選。

1.2.3 miRNA 芯片和生物信息學(xué)分析 miRNA 芯片采用 illumina Xten 測(cè)序平臺(tái)。提取分選后的 Saos-2 的 CD133+和 CD133-細(xì)胞RNA。提取后的 RNA 經(jīng)標(biāo)記后與芯片雜交。利用 seqtk（1.0-r82-dirty）對(duì)預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析，新 miRNA 預(yù)測(cè)使用 miRdeep2（2.0.0.5）軟件，靶基因檢索使用 miRanda（v3.3a）軟件，靶基因查詢及預(yù)測(cè)使用 R 軟件包 multimiR。

1.2.4 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 采用 miRNA isolation kit 提取流式分選后所得的 Saos-2 中CD133+和CD133-細(xì)胞的 miRNA，收集細(xì)胞 2 × 106個(gè)，lysis/binding buffer 振蕩以破解細(xì)胞釋放 miRNA，渦旋后在冰上放置 10 min，9000 ×離心洗脫1 min；加入 100 μl 無 RNA 酶水，蓋緊后最大速度離心 20 ～ 30 s。利用 Bulge-Loop miRNA qRT-PCR primer set 和 qRT-PCR starter kit，預(yù)變性 95 ℃10 min，變性 95 ℃ 2 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸70 ℃ 10 s，40 個(gè)循環(huán)，以 U6 基因作為對(duì)照。

1.2.5 miRNA 抑制 使用不含抗生素的無血清培養(yǎng)基稀釋分選得到 CD133+和CD133-細(xì)胞，以 1 × 105個(gè)/孔接種于六孔板中，過夜培養(yǎng)。miRNA 抑制劑的終濃度為 60 nmol/L，采用 lipofectamine 3000 將 miRNA 抑制劑和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后 4 h，加入無血清培養(yǎng)基。72 h 后，收獲細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 體外自我更新能力的分析 取分選得到細(xì)胞或者 miRNA 抑制劑處理后的細(xì)胞，以500 個(gè)/孔的密度接種于低黏附 24 孔板，用無血清懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)，在 37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，11 d 后觀察成球情況。

1.2.7 體外侵襲實(shí)驗(yàn) 取無血清培養(yǎng)基稀釋后的 Matrigel（1 mg/ml）50 μl 平鋪于 Transwell 小室的上室，放置 37 ℃培養(yǎng)箱 1 h。將分選得到細(xì)胞或者 miRNA 抑制劑處理后的細(xì)胞以 10 萬/ml、200 μl/孔均勻加在 Matrigel 上，Transwell 小室的下室加入含 10% 血清的 Mccoy's 5A 完全培養(yǎng)基。48 h 后，割片、DAPI 封片。

1.2.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將分選得到細(xì)胞或者 miRNA 抑制劑處理后的細(xì)胞調(diào)整濃度為 1 ×106個(gè)/ml，加入 Annexin V 5 μl，避光孵育 15 min，上機(jī)前加入 PI 5 μl，避光孵育 15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS13.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料差異采用2檢驗(yàn)，組間差異采用檢驗(yàn)，< 0.05 時(shí)表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 人骨肉瘤細(xì)胞系 Saos-2 的 CD133+細(xì)胞的分離

采用無血清懸浮培養(yǎng)和表面標(biāo)志物流式細(xì)胞分選術(shù)，檢測(cè)并分選 Saos-2 細(xì)胞中CD133+、CD133-細(xì)胞亞群。圖 1 可知分選 Saos-2 細(xì)胞中 CD133+的比例為 2.1%。

2.2 人骨肉瘤細(xì)胞系Saos-2 的CD133+細(xì)胞生物學(xué)特性的研究

2.2.1 自我更新能力的分析 無血清培養(yǎng)的成球?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，在骨肉瘤細(xì)胞系 Saos-2 中 CD133+細(xì)胞亞群成球數(shù)明顯高于 CD133-細(xì)胞亞群，分別為 34.67 ± 5.033、10.33 ± 2.517（< 0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2）。因此，Saos-2 的 CD133+細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的自我更新能力。

2.2.2 侵襲能力的分析 體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明，在Saos-2 中CD133+細(xì)胞亞群侵襲細(xì)胞數(shù)明顯高于CD133-細(xì)胞亞群，幾乎是 CD133-細(xì)胞亞群侵襲細(xì)胞數(shù)的 2 倍，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（= 0.001）（圖 3）。因此，人骨肉瘤 Saos-2 的 CD133+細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的侵襲能力。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)并分選 Saos-2 細(xì)胞中 CD133+、CD133-細(xì)胞亞群

Figure 1 CD133 expression analysis in Saos-2 cells was detected by FACS

圖2 Saos-2中CD133+和CD133-細(xì)胞亞群自我更新能力的比較（*P < 0.001）（A：統(tǒng)計(jì)圖；B：鏡下觀察）

Figure 2 Comparison of the self-renewal ability in CD133+and CD133-cells from Saos-2 (*< 0.001) (A: Statistical graph; B: Microscopic observation)

圖3 Saos-2 細(xì)胞中CD133+和CD133-亞群侵襲能力的比較（*P < 0.001）（A：統(tǒng)計(jì)圖；B：鏡下觀察）

Figure 3 Comparison of the invasion capacity in CD133+and CD133-cells of Saos-2 cells (*< 0.001) (A: Statistical graph; B: Microscopic observation)

2.3 OSCs 差異表達(dá) miRNA 及其驗(yàn)證

中科普瑞公司采用 illumina Xten 測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，對(duì)分選后的 Saos-2 中 CD133+和 CD133-細(xì)胞亞群進(jìn)行分析。結(jié)果表明：上調(diào) miRNA 共有 15 個(gè)，下調(diào) miRNA 共有 2 個(gè)。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研、相關(guān) miRNA 研究現(xiàn)況及相關(guān)信號(hào)通路，采用 qPCR 技術(shù)對(duì)差異表達(dá)miRNA 表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。與 CD133-細(xì)胞亞群相比，CD133+亞群中 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表達(dá)上調(diào)（相應(yīng)值均為 < 0.0001），miR-3143、miR-3150a-5p 表達(dá)下調(diào)（相應(yīng)值均為 < 0.0001），與高通量 miRNA 測(cè)序表達(dá)結(jié)果相符（圖 4）。

2.4 miRNA 對(duì) OSCs 生物學(xué)特性的調(diào)控作用

2.4.1 對(duì) OSCs 自我更新能力的影響 基于高通量 miRNA 測(cè)序表達(dá)結(jié)果，對(duì)上述上調(diào) miRNA 相關(guān)功能進(jìn)行研究。Saos-2 的 CD133+細(xì)胞中，對(duì)照組成球數(shù)為 40.6 ± 3.1，干擾 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表達(dá)后，無血清培養(yǎng)的成球數(shù)分別為 22.3 ± 3.5、30.7 ± 2.1、32.7 ± 1.5、28.7 ± 2.1（相應(yīng)值為 0.0024、0.0094、0.0154、0.0049），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 5）。因此，抑制 miRNA 表達(dá)后，人骨肉瘤干細(xì)胞的自我更新能力均減弱。

圖4 Saos-2 中 CD133+和 CD133-細(xì)胞亞群差異表達(dá) miRNA 的驗(yàn)證

Figure 4 Verification of expressed miRNAs in CD133+and CD133-cells from Saos-2

圖5 miRNA 對(duì) Saos-2 細(xì)胞中 CD133+細(xì)胞自我更新能力的影響

Figure 5 The effect of miRNAs on the self-renewal capability of CD133+cells in Saos-2 cells

2.4.2 對(duì) OSCs 侵襲能力的影響 Saos-2 的 CD133+細(xì)胞亞群中，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為 217.7 ± 9.6，干擾 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表達(dá)后侵襲細(xì)胞數(shù)分別為：139.3 ± 3.1、127.0 ± 7.6、173.3 ± 5.0、182 ± 6.0（相應(yīng)值為 0.0002、0.0002、0.0021、0.0057）（圖 6）。因此，抑制 miRNA 表達(dá)后，OSCs 的侵襲能力均減弱。

圖6 miRNA 對(duì) Saos-2 細(xì)胞 CD133+細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 6 The effect of miRNA on the invasive ability of CD133+cells in Saos-2 cells

圖7 miRNA 對(duì) Saos-2 細(xì)胞 CD133+細(xì)胞凋亡的影響

Figure 7 The effect of miRNA on the apoptosis of CD133+cells in Saos-2 cells

2.4.3 對(duì) OSCs 細(xì)胞凋亡的影響 Saos-2 的 CD133+細(xì)胞亞群中，通過Annexin-V/PI 染色聯(lián)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)相關(guān)亞群的凋亡情況，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（2.58 ± 0.38）%，干擾 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091 表達(dá)后細(xì)胞凋亡率分別為：（7.14 ± 0.43）%、（7.91 ± 0.13）%、（5.75 ± 0.40）%、（4.76 ± 0.24）%（相應(yīng)值為 0.0002、< 0.0001、0.0006、0.0011）（圖 7）。因此，抑制 miRNA 表達(dá)后，OSCs 的凋亡能力均增強(qiáng)。

3 討論

骨肉瘤是原發(fā)性腫瘤中最常見、惡性程度最高、發(fā)病率最高的惡性骨腫瘤，如何提高治療的有效率，減少骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，是目前臨床中對(duì)骨肉瘤治療的研究重點(diǎn)。根據(jù)腫瘤干細(xì)胞的理論，OSCs 具有自我更新、強(qiáng)致瘤性、多向分化潛能、產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征，目前研究普遍認(rèn)為 OSCs 是惡性骨肉瘤容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。

近年來，已有很多報(bào)道關(guān)于 OSCs 的分選方法，如軟甲基纖維素分選、側(cè)群細(xì)胞分選、流式分選、免疫磁珠分選、無血清培養(yǎng)分選等。上述分選方法可以依據(jù) OSCs 的性質(zhì)和表面標(biāo)志進(jìn)行分類，而大量的文獻(xiàn)報(bào)道的可作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志的分子很多，其中 CD133 是一種跨膜糖蛋白，發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)腫瘤干細(xì)胞，現(xiàn)作為廣譜的標(biāo)記物被應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞的分辨與分離。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)在多個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系中 CD133+細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞特性，確定CD133 為篩選骨肉瘤中腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵性標(biāo)識(shí)。本研究通過無血清懸浮培養(yǎng)和 OSC 標(biāo)志物 CD133 流式分選技術(shù)相結(jié)合成功分離 OSCs。體外功能實(shí)驗(yàn)也證明分離得到的CD133+細(xì)胞具有典型的腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性：較強(qiáng)的自我更新能力、侵襲和耐藥能力。

目前的研究證實(shí) miRNA 在多種腫瘤干細(xì)胞中表達(dá)異常，通過調(diào)節(jié)癌或抑癌基因?qū)δ[瘤干細(xì)胞及腫瘤發(fā)病機(jī)制發(fā)揮重要作用[14]。Mei 等[15]研究表明 miR-33b-3p 通過靶向 DOCK4 來抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移，從而為前列腺癌的治療帶來新希望。Hadavi 等[16]在乳腺癌中發(fā)現(xiàn) miR-3143 可顯著抑制 PIK3CA、AKT1 及相應(yīng)的 mRNA 的表達(dá)，對(duì)術(shù)后診斷具有重要的參考意義。本研究中，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系 Saos-2 中 CD133+與 CD133-細(xì)胞亞群進(jìn)行高通量測(cè)序 miRNA 表達(dá)差異比較，以表達(dá)相差 2 倍以上作為標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分。結(jié)果表明：上調(diào) miRNA 共有 5 個(gè)，下調(diào) miRNA共有 2 個(gè)。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研和相關(guān)miRNA 研究現(xiàn)況，我們重點(diǎn)分析了上調(diào)表達(dá)的 miR-33b-3p、miR-3648、miR-4442、miR-5091和下調(diào)表達(dá)的 miR-3143、miR-3150a-5p。采用 qPCR 技術(shù)對(duì)相關(guān)miRNA 表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證明與 miRNA 表達(dá)譜的結(jié)果相符合。體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：上述上調(diào)表達(dá)的 miRNA 在骨肉瘤干細(xì)胞的自我更新、侵襲和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)特性上具有調(diào)控作用。miR-33b-3p 對(duì)自我更新能力影響最大；miR-3648 對(duì)侵襲和凋亡影響最大。因此，骨肉瘤干細(xì)胞中具有多種差異表達(dá)的miRNA，對(duì)骨肉瘤干細(xì)胞生物學(xué)特性具有調(diào)控作用。

綜上所述，miRNA 在 OSCs 的自我更新、增殖、分化及侵襲等方面起到重要作用。利用 RNA 干擾（RNAi）對(duì)異常表達(dá)的 miRNA 進(jìn)行調(diào)控，從而間接調(diào)控 OSCs 生物特性，以期對(duì)骨肉瘤進(jìn)行干預(yù)。因此，探尋常規(guī)骨肉瘤細(xì)胞和 OSCs 的 miRNA 表達(dá)的差異，抑或發(fā)現(xiàn)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展時(shí)期特異表達(dá)的 miRNA，都將促進(jìn)骨肉瘤診斷與治療的新策略。

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The aberrant expression of microRNA and its influence on biological characteristics of osteosarcoma stem cells

WANG Qian,ZHANG Bo-wen, LUO Peng, GUO Jian-xun, WANG Hong-gang, NIE Jing-jun, WANG Ren-xian, CHEN Da-fu

We aim to investigate the aberrant expression of microRNA (miRNA) in osteosarcoma stem cells (OSCs) and their effects on biological characteristics of OSCs.The serum-free suspension culture and flow cytometry sorting technology were used to isolate human OSCs. Biological characteristics of OSCs were evaluated by sphere colony formation assay, invasion assay and apoptosis assay. miRNA microarray was performed to analyze differentially expressed miRNA in OSCs. Quantitative RT-PCR was used to validate the microarray data of selected miRNA. The effect of miRNA inhibitors on biological characteristics of OSCs were examined.CD133+and CD133-cells from Saos-2 cell line were successfully isolated. Functional studies revealed that CD133+cells from Saos-2 cell line had the characteristics of cancer stem-like cell, which formed more sphere colonies, showed higher invasiveness than CD133-cells. Compared with CD133-cells, 15 highly expressed miRNA and 2 lowly expressed miRNA were identified by miRNA array in CD133+cells. qRT-PCR analysis validated that miR-33b-3p, miR-3648, miR-4442, miR-5091 were up-regulated, and miR-3143 and miR-3150a-5p were down-regulated in CD133+cells from Saos-2 cell line. Inhibition of the up-regulated miRNA (miR-33b-3p, miR-3648, miR-4442, miR-5091) could suppress the self-renewal capacity, invasion ability and enhance apoptosis in CD133+cells from Saos-2 cell line.Several differentially expressed miRNA in human OSCs could regulate biological characteristics of OSCs.

osteosarcoma stem cells; CD133; self-renewal capacity; invasion

Laboratory of Bone Tissue Engineering, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, China

CHEN Da-fu, Email: chendafujst@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.004

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（51973021、52173275）；北京市屬醫(yī)學(xué)科研院所公益發(fā)展改革試點(diǎn)項(xiàng)目（第四批：京醫(yī)研2021-6）

100035北京市創(chuàng)傷骨科研究所骨組織工程研究室/北京積水潭醫(yī)院

陳大福，Email：chendafujst@126.com

2021-12-27