劉藝珠，劉佩冶，趙玉梅，曹建康,

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.北京工商大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，北京 100048）

黃花菜（Hemerocallis citrinaBaroni）為阿?；戚娌輰僦参?，在我國南北各地均有栽培。黃花菜營養(yǎng)豐富，含有多糖、類胡蘿卜素、類黃酮和維生素等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗氧化等活性[1]。

目前，對黃花菜多糖的研究引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。黃花菜多糖可采用水提醇沉法、微波提取法、超聲波提取法、微波處理-水提醇沉法和超聲波處理-水提醇沉法等進行提取，以微波提取法效果最佳[2]。紫外掃描結(jié)果表明多糖幾乎不含核酸和蛋白質(zhì)，紅外光譜顯示黃花菜多糖粗品主要為雜果聚糖[3]。黃花菜多糖具有較強的體內(nèi)抗腫瘤活性[4]，其機制可能與多糖能夠提高機體的免疫功能有關(guān)。黃花菜粗多糖含量隨乙醇提取濃度的升高而增加，對H2O2和·OH自由基的清除效果也明顯增強[5]。黃花菜粗多糖是一種具有α-型吡喃糖苷結(jié)構(gòu)的水溶性雜多糖，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌具有明顯的抑制作用[6]。這些研究表明黃花菜多糖具有較高的應(yīng)用價值，但是，對黃花菜多糖的組成和特征仍缺乏系統(tǒng)的研究。

基于此，擬采用硝酸調(diào)節(jié)水pH至1.8從干黃花菜中提取多糖，研究黃花菜多糖的組成、微觀結(jié)構(gòu)、分子表征，并系統(tǒng)分析其抗氧化能力，以期為黃花菜多糖功能產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干黃花菜 產(chǎn)于湖南祁東，將干黃花菜在80 ℃烘干約8 h至恒重，粉碎，黃花菜粉末保存于干燥器內(nèi)待用；透析袋 截留分子量為10 kDa，購于美國MYM生物科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2-聯(lián)氮-二（ 3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）、2, 4, 6-三吡啶基-S-三嗪（TPTZ） 美國Sigma試劑公司；優(yōu)級純的硝酸等常規(guī)試劑 北京試劑公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍 G-250等 北京化學(xué)試劑公司；葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、巖藻糖、氫氧化鈉、乙酸鈉、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純，Sigma公司。

LGJ-10B 冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；YB-300 高速多功能粉碎機 永康市速鋒工貿(mào)有限公司；AgiLent TechnoLogies 1260體積排阻色譜 美國AgiLent科技有限公司；PE-SP100紅外光譜儀 美國PerkinELmer公司；YP-2 壓片機及模具 上海山岳科學(xué)儀器有限公司；S-3400N 掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；IB-3濺射鍍膜儀 日本Eiko公司；TA60W差熱-熱重同步分析儀 日本島津公司；AR 1500流變儀 美國TA儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取與制備

1.2.1.1 多糖的提取 參考宋賢良等[7]的方法略有修改。量取475 mL蒸餾水，用GR優(yōu)級純的硝酸調(diào)節(jié)pH至1.8，加入25 g黃花菜粉，在75 ℃下振蕩提取3.5 h。在8000 r/min離心10 min，收集上清液。用4～5倍的95%乙醇和上清液混合至乙醇終濃度為80%得到絮狀沉淀。將絮狀沉淀用95%乙醇洗滌沉淀兩次，再用丙酮洗滌兩次除去脂肪和色素類物質(zhì)。最后將洗滌后的沉淀用真空干燥箱在40 ℃下干燥即可得粗多糖，測定、計算粗多糖的得率。

1.2.1.2 Sevag法脫除蛋白 用60 ℃熱水將得到的粗多糖配成10 mg/mL的溶液，磁力攪拌30 min后，置于4 ℃下過夜，使樣品充分溶解。加入等體積的Sevag試劑（V氯仿:V正丁醇=4:1），充分振搖25 min。在4000 r/min離心10 min，棄去下層變性蛋白沉淀，重復(fù)3次。把得到的上清液用截留量為10 kDa的透析袋透析3 d，在-40 ℃真空冷凍干燥，得脫除蛋白的多糖，在干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆?，用于組分分析、表征和抗氧化活性的研究。

1.2.2 多糖組成分析

1.2.2.1 多糖含量測定 采用蒽酮比色法測定[8]。多糖含量以每克多糖組分所含有的葡萄糖毫克數(shù)表示，重復(fù)3次。

1.2.2.2 半乳糖醛酸含量測定 采用咔唑比色法測定[8]。GalUA含量以每克多糖組分中所含有的GalUA毫克數(shù)表示，重復(fù)3次。

1.2.2.3 蛋白質(zhì)含量測定 采用考馬斯亮藍染色法[9]。蛋白質(zhì)含量以每克多糖組分所含有的蛋白質(zhì)毫克數(shù)表示，重復(fù)3次。

1.2.2.4 甲酯化程度測定 參考Virk等[10]的方法略有修改。量取20 mL 0.5%（w/v）的多糖溶液，加入80 mL去CO2水，充分溶解。以酚酞試劑作為指示劑，用0.05 mol/L NaOH滴定至顏色變成粉紅色時，向溶液中再加入15 mL 0.25 mol/L NaOH，在室溫下攪拌30 min以水解酯鍵。再加入15 mL 0.25 mol/L鹽酸以中和溶液。然后，用0.05 mol/L NaOH再次滴定至粉紅色，重復(fù)3次。DM的計算公式為：

式中：DM為甲酯化程度，%；V1為第一次所用NaOH的體積，mL；V2為第二次所用NaOH的體積，mL。

1.2.2.5 單糖組成分析 采用高效陰離子交換色譜分析法[11]。稱取黃花菜多糖10 mg置于水解管中，加入4 mL 2 mol/L的三氟乙酸，充氮1 min以排出管內(nèi)空氣，旋緊螺旋蓋，于120 ℃水解1 h，待冷卻后用氮氣吹干水解液，以除去過量的三氟乙酸，加超純水定容至10 mL。稀釋后，用0.2 μm濾膜過濾，進離子色譜儀分析。

色譜條件：分析柱：Carbo PacTMPA10 4×250 mm analytical；洗脫液：200 mol/L NaOH和1 mol/L NaAc；流速：1 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測器：脈沖安培檢測器，金電極。梯度洗脫條件：A為水，B為200 mol/L NaOH，C為1 mol/L NaAc；0～20 min，91% A，9% B，0% C；20～20.1 min，86% A，9% B，5%C；20.1～35 min，71% A，9% B，20% C。用5 mg/L的混合單糖通過外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，單糖含量以μg/mL表示，重復(fù)3次。

1.2.3 多糖結(jié)構(gòu)與表征

1.2.3.1 掃描電鏡觀察 將黃花菜多糖粘在雙面膠臺上，用濺射鍍膜儀在樣品上鍍上金膜，掃描電鏡觀察。

1.2.3.2 FTIR分析 將溴化鉀于105 ℃干燥6 h，取200 mg溴化鉀于瑪瑙研缽中作空白樣，充分研磨，置于壓片模具中，用壓片機壓制，壓力在25 MPa左右保持60 s，將壓好的片固定于檢測室中，PESP100紅外光譜儀設(shè)置參數(shù)如下：開始：4000 cm-1,結(jié)束：400 cm-1，掃描： T%，掃描次數(shù)：16，選定“T%”為測定指標(biāo)，點擊“基底”掃描空白樣品作為背景。再取2 mg樣品與198 mg溴化鉀一起置于研缽中研磨，然后壓片、固定，掃描得到樣品光譜圖，重復(fù)3次。

1.2.3.3 流變特性分析 參考Wang等[12]的方法略有修改。用60 ℃熱水配制1.0%和2.0%多糖溶液，用磁力攪拌30 min后，置于4 ℃下過夜，使樣品充分水合溶解。選擇流變儀的流動掃描模式，測定剪切速率范圍為0.1～100 s-1，溫度為25 ℃，測定表觀粘度，繪制流變曲線；再選擇流變儀的振蕩幅度模式，使振蕩頻率恒定在1 Hz，在25 ℃下對應(yīng)變進行掃描（0.01%～10%），復(fù)合模量穩(wěn)定的應(yīng)變區(qū)則為線性黏彈區(qū)；在線性黏彈區(qū)內(nèi)選定一恒定應(yīng)變，選擇流變儀的振蕩頻率模式，在25 ℃下對振蕩頻率進行掃描（0.1～10 Hz），測定儲能模量（G'）和損耗模量（G''），重復(fù)3次。

1.2.3.4 多糖分子量測定 參照Wang等[12]的方法略有修改，利用高效體積排阻色譜法測定，配制2 mg/mL的多糖溶液，過0.22 μm水相膜，分析前超聲排氣30 min。取20 μL溶液注入SEC系統(tǒng)進行分析。色譜條件：色譜柱：Agilent PL aquageL-OH MIXED-M 8μm；檢測器：Agilent G7801A示差折光檢測器；流動相：NaNO3溶液；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測器溫度：30 ℃；流動泵：Agilent G1311B四元泵；最大壓力值：130 Bar。標(biāo)準(zhǔn)品為Mw為135.35、64.65、368、13.05、9.75、5.25和2.7 kDa的葡聚糖，濃度為2 mg/mL。

1.2.4 抗氧化活性測定

1.2.4.1 ABTS+·清除能力測定 參照Li等[13]的方法略有修改。將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與5 mL 2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在室溫下避光反應(yīng)16 h，作為ABTS貯液。測定前，用蒸餾水稀釋貯液，使其在波長734 nm處的吸光度值為0.70±0.02，作為工作液。然后向3 mL工作液中加入0.4 mL不同濃度的樣品，劇烈搖晃30 s，避光靜置6 min后，在相同波長處測定吸光度值。重復(fù)3次。ABTS·+清除率按照下式計算：

式中，A0為對照的吸光度值，A1為樣品的吸光度值。

1.2.4.2 FRAP測定 參照Liu等[14]的方法略有修改。將10 mmol/L TPTZ的鹽酸溶液（鹽酸摩爾濃度為40 mmol/L）、20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液和0.3 mol/L的乙酸鈉緩沖溶液（pH3.6）按照1:1:10（v/v/v）混合得到FRAP溶液，并且于37 ℃水浴中溫浴保存，此溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。在120 μL不同濃度的樣品溶液中加入360 μL蒸餾水和3.6 mL FRAP溶液?；靹蚝笥?7 ℃水浴保溫60 min，取出，于波長593 nm處測定吸光度值，以每毫升不同濃度樣品的鐵離子還原能力以反應(yīng)液中FeSO4的摩爾質(zhì)量表示，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016和Origin 9.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差并制圖；用SPSS Statistics 21.0對所有數(shù)據(jù)進行方差分析，并進行Duncans’差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖組成分析

2.1.1 脫除蛋白對黃花菜多糖組分的影響 多糖常與蛋白共存或形成糖蛋白復(fù)合物。Sevag法可利用有機溶劑使溶液中的蛋白質(zhì)變性而分離清除蛋白質(zhì)[11]。結(jié)果表明，黃花菜粗多糖得率、蛋白質(zhì)、多糖、半乳糖醛酸含量分別為2.82%、6.17%、17.93%、17.21%，見圖1。脫除蛋白后多糖得率、蛋白質(zhì)、多糖、半乳糖醛酸含量分別為0.72%、2.55%、34.91%、26.42%。脫除蛋白可以提高多糖的純度，多糖含量和半乳糖醛酸含量分別提高了16.98%和9.21%。DM為被甲酯化羧基數(shù)目占全部羧基數(shù)目的百分比，黃花菜多糖DM值為96.13%±0.3%，屬高酯果膠，適合用作增稠劑和膠凝劑，可用來改善產(chǎn)品口感。

圖 1 脫除蛋白對黃花菜多糖的得率（A）、蛋白質(zhì)（B）、多糖（C）、GalUA（D）含量的影響Fig.1 Effect of the protein removal on the content of the daylily polysaccharide yield (A), protein (B),polysaccharide (C) and GalUA (D)

2.1.2 單糖組成分析 分析黃花菜多糖中的單糖組成，將不同保留時間對應(yīng)的峰值與標(biāo)準(zhǔn)品進行比較，進而確定單糖種類及相對含量。通過與標(biāo)準(zhǔn)品對照得知，黃花菜多糖中半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖含量較高，其他種類糖的含量較低（圖2）。黃花菜多糖的單糖組成摩爾比結(jié)果見表1。黃花菜多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖組成，其中半乳糖為主要成分。黃花菜多糖中半乳糖、葡萄糖、木糖摩爾比為62.50:17.31:11.30。這與周紀(jì)東等[6]發(fā)現(xiàn)的黃花菜粗多糖是一種具有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)的水溶性雜多糖，且可能是一種與蛋白質(zhì)或多肽以共價鍵結(jié)合的糖復(fù)合物類似。

表1 黃花菜多糖中單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of daylily polysaccharides

圖 2 高效陰離子交換色譜圖Fig.2 High performance anion exchange chromatography

2.2 多糖的微觀結(jié)構(gòu)與表征分析

2.2.1 掃描電鏡微觀結(jié)構(gòu) SEM圖像提供了黃花菜多糖的表面形貌特征[15]。SEM結(jié)果表明，黃花菜多糖有疏松片狀結(jié)構(gòu)，相互交叉連接[16]（圖3A）。放大200倍觀察發(fā)現(xiàn)多糖極易破裂形成小孔，可能是多糖分子間存在相互排斥力，分子間吸引力較弱，導(dǎo)致片狀結(jié)構(gòu)斷裂（圖3B）。放大2000倍后看到部分絲狀物質(zhì)相互纏繞成非均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，還有少量顆粒物質(zhì)附著桿狀物質(zhì)表面，使多糖呈現(xiàn)蓬松質(zhì)輕的表觀形態(tài)，分子的規(guī)整性不強，多糖結(jié)構(gòu)中存在較多支鏈，且結(jié)構(gòu)中存在較強的分子間相互作用力[17]（圖3C）。4000倍條件下，可看到表面不平整，有凹陷存在，孔徑四周厚度不均一，呈不規(guī)則的形狀（圖3D）。王帥等[18]研究表明多數(shù)多糖表面具有孔狀的疏松片狀結(jié)構(gòu)。Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在高倍放大倍數(shù)下，多糖表面呈現(xiàn)不均勻的鱗片結(jié)構(gòu)和少量的凹陷。

2.2.2 FTIR分析 傅里葉變換紅外吸收光譜譜圖是化合物分子的“指紋圖”，可以了解化合物的結(jié)構(gòu)信息。黃花菜多糖的FTIR光譜圖（圖4）顯示其具有多糖的一般結(jié)構(gòu)特征[20]。在3412、2912、1368 cm-1這三個波段的吸收峰，即為糖類化合物的特征吸收峰[21]。最寬的吸收發(fā)生在3226～3417 cm-1，它是由O-H的伸縮振動引起的[13,22-23]。2912 cm-1是由CH產(chǎn)生的伸縮振動峰。在1636 cm-1有吸收，這是由酯化C=O伸縮振動引起的[24]，表明多糖中含有較多的酯鍵，為高酯多糖，這與前文DM值結(jié)果一致。1368 cm-1處為C-H彎曲振動吸收峰[20]，1013～1120 cm-1由C-OH、C-O-C和C-C伸縮振動引起，1060 cm-1處的峰證實了吡喃環(huán)構(gòu)象的存在[21]，表明了多糖中存在吡喃環(huán)[23]。以上結(jié)果表明，脫除蛋白后多糖具備碳水化合物典型吸收峰，且存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)[15]。

圖 3 掃描電鏡觀察黃花菜多糖Fig.3 SEM observation of daylily polysaccharide

圖 4 黃花菜多糖的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of daylily polysaccharide

2.2.3 流變特性分析 黏度是多糖最明顯的乳化特征之一[24]。在剪切速率0.1～10 s-1范圍內(nèi)，隨著剪切速率逐漸增大，2%和1%多糖溶液的黏度均迅速下降，溶液呈剪切減薄狀態(tài)（圖5A）。當(dāng)剪切速率大于10 s-1時，溶液的黏度逐漸趨于穩(wěn)定。黃花菜多糖溶液顯示出典型的“假塑性流體”行為，這是由于剪切力使溶液內(nèi)部卷曲連接的分子結(jié)構(gòu)被拉直，纏結(jié)點減少，從而表現(xiàn)為黏度下降[24]。為了進一步探究黃花菜多糖溶液的粘彈性，在恒定頻率1 Hz條件下進行應(yīng)變掃描，以確定線性粘彈區(qū)。2%和1%濃度的黃花菜多糖溶液 G*值變化都比較明顯圖5B），最終確定將黃花菜多糖在應(yīng)變?yōu)?.1%的條件下進行動態(tài)振蕩實驗。

圖 5 黃花菜多糖的流變曲線（A）、應(yīng)變掃描曲線（B）、頻率掃描曲線（C）Fig.5 Rheological curve (A), strain sweep curve (B), frequency sweep curve (C) of daylily polysaccharide

儲能模量G'指粘彈性材料在交變應(yīng)力作用下一個周期內(nèi)儲存能量的能力，通常指彈性；耗能模量G''指在一個變化周期內(nèi)所消耗能量的能力，通常指粘性[25]。黃花菜多糖溶液濃度為1.0%和2.0%時的儲能模量（G'）隨著振蕩頻率的增大均增大，在振蕩頻率為1 Hz之前濃度為1.0%和2.0%時損耗模量（G''）均有小幅度的波動變化，隨后隨著振蕩頻率的增大均增大（圖5C）。在各濃度下，其G'均大于G''[25-26]，表明在0.1～10 Hz整個頻率范圍內(nèi)，多糖溶液表現(xiàn)出彈性行為，呈現(xiàn)凝膠性質(zhì)[25]。

2.2.4 分子量分布 黃花菜多糖的分子量分布較寬，有兩個峰（圖6）。表2詳細列出了多糖組分的分子量分布情況，組分的分子量較大，重均分子量（Mw）更適合表征它們的分子量[27]。黃花菜多糖峰 1分子量較高，Mw為1310.32 kDa，黃花菜多糖半乳聚糖、阿拉伯聚糖等中性糖側(cè)鏈含量最為豐富，較高的分支化程度使得其擁有較高的Mw[28]；分散性也很大，PD為2.24。黃花菜多糖峰 2分子量相對小很多，Mw為83.81 kDa。多糖來源和制備方法的不同會導(dǎo)致單糖組成和分子量的較大差異，從而影響其生物功能活性[29]。同一來源的多糖由于其分子量的不同，往往具有不同的功能活性，較高分子量的多糖具有更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其表現(xiàn)出的生物活性也更為廣泛，分子量過低，難以形成具有活性的聚合結(jié)構(gòu)[30]。

表2 黃花菜多糖的分子量分布情況Table 2 Molecular weight distribution of daylily polysaccharide

圖 6 黃花菜多糖的HPSEC色譜圖Fig.6 HPSEC chromatogram of daylily polysaccharide

2.3 多糖的抗氧化活性

隨著黃花菜多糖溶液濃度的增加ABTS+·清除能力整體呈逐漸增加的趨勢，在5 mg/mL時ABTS+·清除能力達到78.99%（圖7A）。FRAP法可作為樣品中的總抗氧化能力的指標(biāo)[31]。黃花菜多糖的FRAP能力在低濃度時隨濃度增大變化幅度較小，當(dāng)濃度大于0.1 mg/mL，黃花菜多糖的FRAP能力隨濃度增大而增大，在5 mg/mL時FRAP值達732.75 mmol FeSO4/mL?？梢姡S花菜多糖的鐵離子還原能力與濃度成正相關(guān)（圖7B），表明黃花菜多糖具有較好的抗氧化能力，這可能與多糖的單糖組成相關(guān)[18]。此外，有研究報道，分子量也是影響多糖抗氧化性的一方面因素[32]，分子量高的多糖，生物活性往往較高[18]。多糖的活性還與糖苷鍵、空間構(gòu)象等有密切關(guān)系，但需要進一步的研究[32]。

圖 7 黃花菜多糖的ABTS+·清除能力（A）、FRAP能力（B）Fig.7 Daylily polysaccharide ABTS+· scavenging ability (A),FRAP ability (B)

3 結(jié)論

探討了脫除蛋白后黃花菜多糖的結(jié)構(gòu)特性和抗氧化活性，探索了多糖在食品工業(yè)中的潛在應(yīng)用。結(jié)果表明，黃花菜中提取多糖得率為0.72%，純度為34.91%。掃描電鏡觀察到黃花菜多糖呈絮狀結(jié)構(gòu)，互相連接。黃花菜多糖含有高甲酯程度，為大分子量多糖；黃花菜多糖主要由半乳糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖組成，其中半乳糖為主要成分。FTIR分析表明多糖含有明顯的酯鍵，且存在吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。黃花菜多糖溶液顯示出典型的“假塑性流體”行為，具有凝膠性質(zhì)。體外抗氧化活性表明，黃花菜多糖對ABTS+·的清除效果和FRAP能力較明顯。該研究表明，黃花菜多糖是一種潛在的天然抗氧化劑和膠凝劑，在營養(yǎng)健康產(chǎn)業(yè)具有一定的開發(fā)應(yīng)用前景。