劉學(xué)貴，李知明，劉長風(fēng)，周靜瑤，王瑤瑤，高品一, ，李丹琦

（1.沈陽化工大學(xué)功能分子研究所，遼寧沈陽 110142；2.硼鎂資源開發(fā)與精細(xì)化工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110142；3.沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142；4.沈陽化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽 110142；5.遼寧省綠色功能分子設(shè)計(jì)與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽 110142）

高脂血癥（hyperlipidaemia，HLP）是由本身血脂代謝異常而引起的疾病，常表現(xiàn)為血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低或總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高[1]。高脂血癥不僅僅是肥胖和2型糖尿病等疾病的致病因素，還與高血壓、脂肪肝、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝型疾病密切相關(guān)[2]。目前，高脂血癥的治療藥物以西藥辛伐他汀、普伐他汀、非諾貝特、氯貝特等為主[3-4]，這類藥物具有明確效果，但靶點(diǎn)單一，長期使用常伴有副作用，如胃腸道不良反應(yīng)、肝腎功能損害等，并且停藥后反彈幾率高[5]。因此，植源性藥物的研究成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)[6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物中的黃酮類和皂苷類等化學(xué)成分能夠?qū)Ω闻K脂質(zhì)代謝系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而達(dá)到降血脂的目的[7]。

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名山里紅，薔薇科山楂屬，落葉喬木。山楂具有降血脂、血壓、強(qiáng)心、抗心律不齊等作用[8]。大多數(shù)山楂屬植物具有深綠色的葉子，白色的花和深紅色的果實(shí)[8]。山楂葉是山里紅的干葉，三角卵形或?qū)捖研?，無毛，鋸齒在邊緣處，具有3～7片裂片，味澀，微苦[9-11]。山楂葉作為藥用植物有著悠久的歷史，其已用于癌癥、心血管疾病和糖尿病的治療[12-16]。刁婷婷等[17]以高脂血癥大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過山楂葉總黃酮灌胃處理的大鼠肝臟組織中的（AMPK）表達(dá)增加，脂肪酸合成速度減緩，脂質(zhì)代謝能力加強(qiáng)，并且脂肪變性程度有所減輕。肖峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮可以調(diào)節(jié)血脂水平，降低游離脂肪酸含量，進(jìn)而起到抗炎抗氧化損傷的作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)綜合性的概念，是在當(dāng)前環(huán)境下將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)相互結(jié)合而衍生出來的一門新興學(xué)科。2007年英國科學(xué)家Hopkins為了研究多組分藥物之間的協(xié)同性和規(guī)律性，以尋找低毒性和高效性的藥物，提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一概念[19]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要是通過網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方式將網(wǎng)絡(luò)信號靶點(diǎn)和傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，不但為尋找中藥和方劑的作用機(jī)制提供了新的方法，而且還可以加快藥物的研發(fā)進(jìn)程[20]。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探究了山楂葉有效成分對高脂血癥疾病網(wǎng)絡(luò)的作用機(jī)制，進(jìn)而預(yù)測出山楂葉中抗高脂血癥的良好化合物以及對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，為山楂葉中活性化合物的開發(fā)與利用提供支持。

1 材料方法

1.1 材料與儀器

葒草苷 阿拉丁生化科技股份有限公司；齊墩果酸、毛蕊花糖苷、蘆丁、牡荊素、4%多聚甲醛、油酸、異丙醇、阿托伐他丁 上海麥克林生化科技有限公司；牡荊素-2＂-O-鼠李糖 由作者課題組分離、純化和制備得到；ERK2激酶 日本Carna公司；Staurosporine（星形孢菌素） 美國Med Chem Express公司；DMSO、MgCl2、DTT、Triton X-100、Brij-35、ATP

美國Sigma公司；Peptide 8 島津GL公司；HEPES、EDTA、10%胎牛血清 澳洲Gibco公司；人體肝癌HepG2細(xì)胞株 上海富衡生物科技有限公司；MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶 美國Hyclone公司；油紅O染液、蘇木素染液、PBS緩沖液、甘油三酯（ TG ）試劑盒、BCA蛋白測定試劑盒 南京建成科技有限公司；4% 組織細(xì)胞固定液 北京索萊寶科技有限公司。

CLM-170B-8-NF酶標(biāo)儀、二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱

美國Thermo公司；TS-1恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AE31E倒置顯微鏡 美國Motic公司；BS 224 S電子分析天平 瑞士梅特勒托利多公司；HH-ZK2恒溫水浴鍋 鄭州予儀器制造有限公司；TGL-16醫(yī)用離心機(jī) 湘儀集團(tuán)；LX-B35 L自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物的收集和結(jié)構(gòu)處理 經(jīng)過對山楂葉化學(xué)成分文獻(xiàn)的調(diào)研和本實(shí)驗(yàn)組前期工作，共整理出116個(gè)以黃酮類化合物為主的化合物[21-27]，使用Chem Biodraw Ultra 14.0軟件繪制其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并以MOL2格式進(jìn)行保存。

1.2.2 高脂血癥潛在靶點(diǎn)的收集 以“Hyperlipidemia”、“Hyperlipemia”、“High cholesterol”等為關(guān)鍵詞，利用GeneCards數(shù)據(jù)庫、Therapeutic Target Database、DrugBank以及Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，查找篩選出40個(gè)分辨率不高于3.0 ?且擁有原始配體的人源靶點(diǎn)蛋白。

1.2.3 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 利用Sybyl-X（version 2.0，Tripos，Inc.）對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行修飾，將修飾好的蛋白和保存好的MOL2格式的化合物進(jìn)行半柔性分子對接，將對接得分大于8的化合物和靶點(diǎn)蛋白共同導(dǎo)入Excel表格，利用Cytoscape v3.7.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.2.3得到的山楂葉活性成分和高脂血癥交集的靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫，群種定義為人類，最小交互閾值設(shè)置為0.4，其他參數(shù)默認(rèn)。將得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape v3.7.1軟件中，生成PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.5 GO生物過程和KEGG信號通路富集分析

將需要分析的基因提交到DAVID平臺中，選定人的全基因作為背景，對疾病的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，得到生物過程、細(xì)胞成分、分子功能和關(guān)鍵信號通路的富集信息，利用R軟件對富集P值小于0.05的功能進(jìn)一步分析。

1.2.6 “化合物-靶點(diǎn)-信號通路”構(gòu)建 將化合物、信號通路和靶點(diǎn)之間的聯(lián)系利用Cytoscape v3.7.1軟件建立，即構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)以識別他們之間的關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)特征分析由軟件中的“network analyzer”程序完成以此來初步得出化合物與靶點(diǎn)蛋白之間的作用情況和靶點(diǎn)蛋白在相關(guān)通路之間的聯(lián)系。

1.2.7 ERK2激酶抑制活性實(shí)驗(yàn) 絲裂原活化蛋白激酶MAPK，是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基端激酶（JNK）、p38MAPK、ERK5[28]，MAPK的激活是脂肪形成的重要組成部分[29]。ERK是MAPK主要的通路之一，位于MAPK通路的下游，MAPK的所有突變和擴(kuò)增最終都會(huì)導(dǎo)致ERK的異常激活[30-31]。細(xì)胞中脂滴的形成依賴于ERK2的激活，抑制ERK2能顯著降低VLDL脂解后的脂滴積累[32]。同時(shí)，一些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明一些促脂肪劑抑制MEK/ERK活性可以阻止脂肪細(xì)胞的生成，降低體內(nèi)整體血脂水平以治療高脂血癥[33]。因此，抑制ERK2被認(rèn)為是治療高脂血癥的潛在途徑。

本文以ERK2為靶酶，STS（星形孢菌素）為陽性對照藥，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，結(jié)合實(shí)驗(yàn)組前期從山楂葉中分離得到的代表性和量大的化合物，選取6個(gè)（牡荊素、齊墩果酸、毛蕊花糖苷、蘆丁、葒草苷、牡荊素-2-O鼠李糖苷）委托上海睿智化學(xué)研究有限公司采用遷移率改變法[34]進(jìn)行活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

制備激酶液（50 mmol/L HEPES，pH7.5，0.01%Triton X-100）和停止液（100 mmol/L HEPES，pH7.5，0.015% Brij-35，0.2 % 涂層試劑 #3，50 mmol/L EDTA）。

將待測化合物在DMSO中制備成10 mmol/L的儲(chǔ)備液。隨后再用DMSO稀釋至5000 μmol/L。取100 μL，添加到96孔板中。利用梯度稀釋的方法將化合物配制成100、10 μmol/L和1 μmol/L的稀釋液。

取5 μL的稀釋液加入到混合有10 μL DMSO和90 μL的1×激酶緩沖液的檢測板中。在1×激酶基緩沖液中加入激酶，配成2.5×酶溶液。在檢測板上每孔加入10 μL 2.5×酶液，在室溫條件下孵育10 min。孵育完成后向每個(gè)孔中加入10 μL的2.5×肽溶液（在1×激酶緩沖液中含有FAM標(biāo)記的肽、ATP以及MgCl2的肽溶液）以開始反應(yīng)，并在28 ℃的環(huán)境中孵育30 min。加入25 μL停止液，反應(yīng)結(jié)束。

使用EZ ReaderⅡ（Caliper Life Sciences，Waltham，MA，USA）（下游電壓-500 V，上游電壓-2250V，基礎(chǔ)壓力-0.5 PSI，屏幕壓力-1.2 PSI）對所有樣品進(jìn)行分析，以讀取轉(zhuǎn)換值，抑制率百分比如式1所示。

注：max代表DMSO對照的轉(zhuǎn)換值；min代表無酶對照的轉(zhuǎn)換值；conversion代表給定化合物劑量下的轉(zhuǎn)換值。

1.2.8 分子對接 本文利用Auto Dock vina 1.1.2軟件基于ubuntu 20.04系統(tǒng)進(jìn)行對接。蛋白被設(shè)定一個(gè)分子口袋后，小分子以半柔性對接的方式與其對接。對接完成后對小分子和蛋白之間的結(jié)合能力進(jìn)行打分。根據(jù)得分高低判斷其相互作用力。

本文將陽性對照藥（STS）、牡荊素、齊墩果酸、蘆丁、葒草苷、牡荊素-2 O鼠李糖苷和毛蕊花糖苷分別與ERK2（4QTA）對接。

1.2.9 高脂HepG2細(xì)胞模型建立與甘油三酯含量測定 作為檢測組織內(nèi)油脂的常用試劑，油紅O能夠使脂肪組織及細(xì)胞內(nèi)的脂滴著色[35]，而被廣泛用于臨床和科研病理的工作中[36]。本文采用油紅O對油酸處理的HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色。HepG2細(xì)胞用含10% 胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在培育箱中孵育。待生長密度達(dá)80%～90%時(shí)吸取2 mL的細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)（約15萬個(gè)/孔），置于37 ℃，5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h，設(shè)置空白組、油酸模型組和藥物處理組，如表1所示。

表1 細(xì)胞加藥方法Table 1 Operation method of cell administration

將六孔板中的培養(yǎng)液吸出，用PBS和60%異丙醇分別將細(xì)胞漂洗兩次，避光條件下加入1 mL油紅O染液，在37 ℃恒溫箱下保持15 min，用60%異丙醇和蒸餾水分別進(jìn)行漂洗，之后加入0.5 mL蘇木素，復(fù)染30 s。用顯微鏡觀察，采集清晰圖像，并用100%異丙醇提取染色脂滴，在490 nm處測定其吸光度。

有研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他?。ˋTS，一類降低人體內(nèi)膽固醇水平的藥物）可以有效降低體內(nèi)的血脂水平[37]達(dá)到降血脂的目的。本文為檢驗(yàn)?zāi)登G素對脂質(zhì)的抑制作用效果，在油酸存在的情況下，用100 μmol/L阿托伐他汀處理油酸組HepG2細(xì)胞作為陽性對照組，然后用油紅O進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察，并在490 nm處測定其吸光度。另取一塊培養(yǎng)條件相同的六孔板去除其上的培養(yǎng)液，用胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化。然后在室溫條件下，將細(xì)胞懸液放入離心機(jī)，以1000 r/min離心10 min，去除上清液，將0.5～1 mL的PBS加入進(jìn)細(xì)胞沉淀中混勻，重復(fù)操作1～2次，并在冰上加入裂解液進(jìn)行裂解。裂解后按照說明書操作TG試劑盒，用酶標(biāo)儀檢測波長510 nm處的吸光度，用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，計(jì)算甘油三酯含量（如式2所示）。

2 結(jié)果與分析

2.1 有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖分析

圖 1 化合物-靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network of compound-target protein

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析山楂葉中116個(gè)活性成分和40種高脂血癥相關(guān)蛋白靶點(diǎn)的相互作用，分析結(jié)果表明山楂葉中有93種化合物分別與這40種高脂血癥的蛋白可以相互結(jié)合。將對接得分大于8的化合物與蛋白匯總到Excel表格中并導(dǎo)入Cytoscape v3.7.1中（如圖1所示）。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)以網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表示，其中正方形代表高血脂的靶點(diǎn)蛋白，圓形代表山楂葉中的活性化合物。通過Network Analysis分析，結(jié)果如下：該網(wǎng)絡(luò)由133個(gè)節(jié)點(diǎn)和441條邊組成，網(wǎng)絡(luò)異構(gòu)性為1.167，網(wǎng)絡(luò)密度為0.050，網(wǎng)絡(luò)的半徑和直徑分別為4和6，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.349，特征路徑長度為2.793，相鄰平均數(shù)目為6.632。其中，Erythro-1-（4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-methoxyphenyl）-2-[4-（3-hydroxypropyl）-2,6-dimethoxyphenoxy]-1,3-propanediol（112）、Verbascoside（111）、（7S, 8R）-5-Methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-Dglucopyranoside（113）、Acernikol-4''-O-β-D-glucopyranoside（107）、（2,3-Dihydro-2-（4-O-β-D-glueopyranosyl-3-methoxy-Phenyl）-3-hydroxymethyl-5-（3-hy droxypropyl）-7-methoxybenzofuran）（108）、Rutin（1）等為山楂葉抗高脂血癥的潛在化合物，靶點(diǎn)蛋白3V99（Arachidonate 5-lipoxygenase）、3WEG（Squalene synthase）、3E7G（Nitric-oxide synthase inducible）、1N5U（Serum albumin）、6A93（Hydroxytryptamine receptor 2A）、4QTA（Mitogen-activated protein kinase 1）、3CCZ（HMG-CoA reductase）、3TJM（Fatty acid synthase）等為治療高脂血癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析

將分子對接得到的40個(gè)潛在基因靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫中以構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape v3.7.1進(jìn)行可視化處理（如圖2所示）。由圖2可知，該網(wǎng)絡(luò)平均節(jié)點(diǎn)度為13.2，平均局部聚類系數(shù)為0.791。圖中共計(jì)包含40個(gè)節(jié)點(diǎn)，263條邊。節(jié)點(diǎn)的顏色及大小和高脂血癥蛋白靶點(diǎn)的度成正相關(guān)，在PPI網(wǎng)絡(luò)中顏色越深代表他們之間的相互作用關(guān)系越強(qiáng)。從圖2可以看出，PPARG、GAPDH、ALB、AKT1、INS直至MAPK1等節(jié)點(diǎn)顏色深且較大，說明這些靶點(diǎn)可能在高血脂癥的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

圖 2 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network of protein-protein interaction

2.3 GO和KEGG富集分析

將40個(gè)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物富集和KEGG信號通路富集分析。GO分析結(jié)果表明與生物過程（BP）有關(guān)的項(xiàng)目為163個(gè)，與分子功能（MF）相關(guān)的項(xiàng)目為48個(gè)，與細(xì)胞成分（CC）相關(guān)的項(xiàng)目為30個(gè)。挑選出前15個(gè)繪制條形圖（如圖3所示）。多靶點(diǎn)在BP中對膽固醇生物合成過程、脂質(zhì)代謝過程、脂蛋白代謝過程、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、膽固醇體內(nèi)平衡等有較大影響；在CC中對小腔影響較為突出，對高爾基體、胞質(zhì)、細(xì)胞外空隙、核漿等都有影響；在MF中對藥物結(jié)合、類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性和配體活化序列特異性DNA結(jié)合、酶結(jié)合、一致的蛋白質(zhì)結(jié)合等均有重要影響。

在KEGG富集分析中將前20個(gè)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的通路（P＜0.01）繪制成氣泡圖（如圖4所示）。在氣泡圖中，氣泡越大代表著所在通路富集的基因越多，同時(shí)氣泡顏色越深代表基因靶點(diǎn)在此通路上的富集程度越高。由圖4可知，與高脂血癥較為密切的靶點(diǎn)信號通路主要涉及代謝通路、AMPK信號通路、HIF-1信號通路、胰島素抵抗、甲狀腺激素信號通路、PPAR信號通路、卵巢類固醇生成。

脂質(zhì)代謝是細(xì)胞將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為能量的關(guān)鍵過程，是膜生物發(fā)生和信號分子產(chǎn)生的基礎(chǔ)。在代謝活躍的細(xì)胞中，來自線粒體的活性氧過量，細(xì)胞外介質(zhì)作用和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激都可以啟動(dòng)炎癥通路從而啟動(dòng)炎癥。Song 等[38]研究發(fā)現(xiàn)黑米花色苷能通過調(diào)節(jié)肥胖小鼠脂代謝和腸道菌群緩解高脂血癥、肝臟脂肪變性和胰島素抵抗。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的主要轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)，一般情況下會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的酶迅速降解，只有在缺氧的情況下才可穩(wěn)定表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子的上調(diào)能夠增強(qiáng)高脂大鼠缺血后的心臟保護(hù)作用[39]。絲裂原活化蛋白激酶（AMPK），即AMP依賴的蛋白激酶，其在各種與代謝相關(guān)的器官中均有表達(dá)，并且能被機(jī)體以各種方式刺激激活。藥理學(xué)和遺傳學(xué)研究表明，AMPK能使機(jī)體內(nèi)的葡萄糖維持一個(gè)相對穩(wěn)定的平衡。孫樂[40]研究發(fā)現(xiàn)粗壯女貞總苷能夠通過促進(jìn)肝臟中LKB1磷酸化來激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)代謝，降低高脂金黃地鼠血脂水平。綜上，山楂葉中活性成分可能是通過以上通路為主其他多信號通路相互協(xié)調(diào)發(fā)揮抗高血脂癥的效用。

2.4 化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)分析

如圖5所示，在化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)分析中圓形代表山楂葉中化學(xué)成分，菱形代表高血脂相關(guān)靶點(diǎn)，箭頭代表KEGG富集篩選出的信號通路。該網(wǎng)絡(luò)根據(jù)鏈接值排序，鏈接值越大，節(jié)點(diǎn)面積越大、顏色越深，該網(wǎng)絡(luò)包括153個(gè)節(jié)點(diǎn)、1747條邊、20個(gè)箭頭型節(jié)點(diǎn)代表的信號通路和40個(gè)菱形節(jié)點(diǎn)代表的高脂血癥靶蛋白以及93個(gè)圓形節(jié)點(diǎn)代表的山楂葉化學(xué)成分，該網(wǎng)絡(luò)半徑和直徑分別為3和4，多邊緣節(jié)點(diǎn)對為263，相鄰平均條目為17.294，特征路徑長度為2.134，異構(gòu)性為0.915，中心度為0.585，網(wǎng)絡(luò)密度為0.114，聚類系數(shù)為0.260。由圖5可知：化合物112（erythro-1-（4-O-β-D-glucopyranosyl-3-methoxyphenyl）-2-[4- （3-hydroxypropyl）-2,6-dimethoxyphenoxy]-1,3-propanediol）、111（verbascoside）、108（（2,3-Dihydro-2-（4-O-β-D-glueopyranosyl-3-methoxy-Phenyl）-3-hydroxymethyl-5-（3-hydroxypropyl）-7-methoxybenzofuran））、107（acernikol-4''-O-β-Dglucopyranoside）、95（norhawthornoid A）、113（（7S,8R）-5-methoxydihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-D-glucopyranoside）、110（（7S,8R）-urolignoside）、1（rutin）、115（（+）-lariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside）、63（linarionoside B）等在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中起重要的調(diào)控作用。有可能抗高血脂的關(guān)鍵靶點(diǎn)為ALOX5、FDFT1、MAPK1、NOS2、CYP7A1、ALB、HTR2A、SLC2A1、HMGCR、FASN，關(guān)鍵信號通路為Metabolic pathways、Pathways in cancer、Toxoplasmosis、HIF-1 signaling pathway、Ovarian steroidogenesis、PPAR signaling pathway、AMPK signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、Insulin signaling pathway、Serotonergic synapse等。

圖 3 靶蛋白的GO富集分析圖Fig.3 GO enrichment analysis of target proteins

圖 4 高脂血癥相關(guān)潛在靶點(diǎn)的KEGG分析圖Fig.4 KEGG analysis of potential targets related to hyperlipidaemia

圖 5 化合物-靶點(diǎn)-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network of compound-target-signal pathway

2.5 激酶驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖6所示。由表2和圖6可知，樣品濃度和抑制率呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)化合物測試濃度為100 μmol/L時(shí)，牡荊素對ERK2抑制率最高為84%，牡荊素-2"-O-鼠李糖抑制率最弱，抑制率僅為3%。陽性對照藥IC50值為0.470 μmol/L，牡荊素IC50值為20.422 μmol/L，其值雖高于陽性對照藥，但其仍表現(xiàn)出對ERK2激酶較好的抑制活性。所以，可以認(rèn)為牡荊素通過對ERK2的抑制以達(dá)到降血脂的目的。牡荊素是山楂葉中含量較高的代表性化合物，有報(bào)道稱其含量可達(dá)到31.39%[41]，由此，表明在山楂葉抗高脂血癥的過程中，牡荊素可能通過與高脂血癥的關(guān)鍵靶蛋白相互作用以達(dá)到降血脂的目的。

表2 化合物酶抑制活性測試結(jié)果Table 2 Test results of enzyme inhibitory activity of the compounds

圖 6 化合物的ERK2激酶抑制活性Fig.6 Inhibitory ERK2 kinase activity of the compounds

2.6 分子對接模式驗(yàn)證

本文利用分子對接模式來驗(yàn)證六種化合物和陽性對照藥（STS）與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能。分子對接的結(jié)合能越低，說明配體與受體之間相互作用的可能就越大；一般情況下，當(dāng)結(jié)合能小于-5 kcal/mol時(shí)代表兩者之間具有良好的結(jié)合性[42]。將陽性對照藥（STS）、牡荊素、齊墩果酸、蘆丁、葒草苷、牡荊素-2 O鼠李糖苷和毛蕊花糖苷分別與ERK2（4QTA）對接，結(jié)合能分別為：-9.8、-9.6、-9.4、-8.8、-4.6、-3.9和-3.1 kcal/mol。將對接結(jié)果小于-5 kcal/mol的化合物進(jìn)行分析，STS與ERK2的GLU-33、LYS-54、TYR-36等殘基結(jié)合（如圖7A）；牡荊素與LYS-54、SER-153、TYR-36等殘基結(jié)合（如圖7D）；齊墩果酸與SER-153、LYS-151、TYR-36等殘基結(jié)合（如圖7B）；蘆丁為與LYS-151、SER-153、LYS-54和TYR-36相互結(jié)合（如圖7C）。

對接結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)組中牡荊素與ERK2的結(jié)合能最低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與激酶實(shí)驗(yàn)測定的活性結(jié)果相一致。從另一角度驗(yàn)證了激酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。并且從對接結(jié)果可以推測，殘基LYS-54和TYR-36可是抑制ERK2激酶活性的主要?dú)埢?/p>

2.7 油紅O染色及定量試驗(yàn)結(jié)果

將處理后的細(xì)胞用油紅O進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察，脂滴顯示為鮮紅色。并在490 nm處測定其吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，濃度為100 μmol/L的阿托伐他汀可減少12.2%的脂滴堆積；分別加入100、50 μmol/L和25 μmol/L的牡荊素后，脂滴聚集分別減少5.4%、2.2%和2.1%，說明牡荊素對脂滴的聚集有一定的抑制作用，且隨著濃度增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)如圖8和圖9所示。

圖 7 結(jié)合能最低的分子對接模式Fig.7 Docking mode with lowest binding energies

圖 8 油紅O染色圖Fig.8 Oil red O staining chart

圖 9 油紅O染色定量分析結(jié)果Fig.9 Quantitative analysis results of oil red O staining

2.8 甘油三酯（TG）含量測試結(jié)果

牡荊素對高脂HepG2細(xì)胞甘油三酯含量的影響如表3所示。與空白組相比較，油酸模型組內(nèi)的TG含量明顯增加。當(dāng)牡荊素濃度為25、50 μmol/L和100 μmol/L時(shí)，其處理的細(xì)胞的TG含量相比于模型組都有一定程度的降低，并且呈現(xiàn)濃度依賴，濃度為100 μmol/L的效果最好。因此，牡荊素有望作為一種降低細(xì)胞內(nèi)血脂含量的潛在治療化合物。

表3 牡荊素對高脂HepG2細(xì)胞甘油三酯含量的影響Table 3 Effect of vitexin on triglyceride content in high-fat HepG2 cells

3 結(jié)論

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對山楂葉所含有的化合物進(jìn)行了活性篩選、靶點(diǎn)分析和相關(guān)靶點(diǎn)通路預(yù)測，篩選得到93個(gè)活性化合物和40個(gè)潛在的高脂血癥靶點(diǎn)蛋白以及20個(gè)相關(guān)靶蛋白的信號通路。在ERK2激酶活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，以STS為陽性對照藥，齊墩果酸、葒草苷、毛蕊花糖苷、蘆丁、牡荊素、牡荊素-2＂-O-鼠李糖為待測化合物。上述化合物對激酶都有一定的抑制活性，牡荊素效果最好，其抑制率達(dá)到84%，IC50值為20.422 μmol/L。通過分子對接模式，以結(jié)合能為指標(biāo)對激酶結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明牡荊素與ERK2蛋白的LYS-54、SER-153、TYR-36等殘基能相互結(jié)合，結(jié)合能最低為-9.6 kcal/mol，與激酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以HepG2細(xì)胞建立高脂血癥模型，阿托伐他汀為陽性對照藥，當(dāng)濃度為100 μmol/L時(shí)，牡荊素脂滴減少了5.4%，說明牡荊素對脂滴的聚集有一定的抑制作用，且隨著濃度增大，其抑制作用逐漸增強(qiáng)。甘油三酯試劑盒測定實(shí)驗(yàn)中，甘油三酯含量隨著牡荊素增加而減少。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測山楂葉中牡荊素對高脂血癥具有較好抑制作用。