周 健，曹婷婷，2，曹俊新，趙云翔，2

（1.廣西貴港秀博基因科技股份有限公司，廣西 貴港 537100；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528000）

公豬精子對(duì)溫度變化十分敏感，在冷凍保存過程中極易受到冷凍損傷，雖然Polge等[1]在1956年首次運(yùn)用凍精技術(shù)進(jìn)行人工授精（AI）并獲得仔豬，但是到目前為止世界范圍內(nèi)豬冷凍精液應(yīng)用比例仍沒超過1%。冷凍保護(hù)液是影響凍精冷凍效果的主要因素之一，目前常用以卵黃為基礎(chǔ)的稀釋液添加冷凍保護(hù)劑來進(jìn)行凍精研究。常用的冷凍保護(hù)劑有甘油、DMSO（二甲基亞砜）、乙二醇等，這些滲透性冷凍保護(hù)劑雖然具有優(yōu)異的抗凍作用，但均具有細(xì)胞毒性，所以多數(shù)會(huì)在冷凍前進(jìn)行添加，以降低不良影響。一步稀釋法和兩步稀釋法進(jìn)行精液冷凍主要是針對(duì)冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性衍生出來的冷凍方法，雖然現(xiàn)在以兩步稀釋法冷凍公豬精液在實(shí)驗(yàn)室層面得到滿意且穩(wěn)定的冷凍效果，但兩步稀釋法在實(shí)際生產(chǎn)中會(huì)增加處理時(shí)間。為提高生產(chǎn)效率，進(jìn)行一步稀釋冷凍試驗(yàn)，探索一步稀釋法冷凍豬精技術(shù)。據(jù)相關(guān)報(bào)道，不同稀釋方法的凍精研究已在絨山羊[2]、牛[3]、犬[4]等動(dòng)物上得到應(yīng)用，但冷凍效果參差不齊。為了提高精子的凍融質(zhì)量，OEP （Orvus ES Paste）、ESP（Equex STM Paste）作為新型冷凍保護(hù)劑已被應(yīng)用到凍精研究中。OEP、ESP是一類表面活性劑，對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)有保護(hù)修補(bǔ)作用，主要含有十二烷基硫酸鈉（SDS）復(fù)合物，能夠提高凍融精子活率、活力及質(zhì)膜完整率[5]。精液在超低溫下可以長(zhǎng)期有效的保存，這對(duì)于保護(hù)種豬種質(zhì)資源及基因傳遞具有突出的優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及精液采集

試驗(yàn)動(dòng)物為沈陽秀博種豬繁育科技有限公司提供的體質(zhì)健壯、性欲旺盛的6頭成年杜洛克公豬，采集2021年12月份公豬精液作為樣本，在揚(yáng)翔農(nóng)牧育種中心北方凍精實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試驗(yàn)。每頭公豬精液均分成2份，每份3個(gè)重復(fù)，分別進(jìn)行一步稀釋法冷凍精液和兩步稀釋法冷凍精液。使用自動(dòng)采精設(shè)備對(duì)試驗(yàn)公豬進(jìn)行原精采集，通過精液傳動(dòng)系統(tǒng)將采集好的原精傳送到精液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，利用IVOS II（法國(guó)，IMV）精子自動(dòng)檢測(cè)儀進(jìn)行精液質(zhì)量評(píng)估。原精要求：精子活力≥90%，精子密度≥2億/mL，精子畸形率≤10%。

1.2 主要試驗(yàn)儀器及試劑

TurboFreezerM程序冷凍儀（米尼圖）、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華）、EasyCoder 2.0色帶打印機(jī)（米尼圖）、KDC-2046低速冷凍離心機(jī)（安徽中科）、冷凍精子平衡柜（米尼圖）、精子檢測(cè)分析儀（IVOS II, IMV）、單頭灌裝機(jī)MPPUno（米尼圖）、0.5 mL凍精細(xì)管（米尼圖）。甘油（Sigma）、乳化劑Equex-Paste（米尼圖）、檸檬酸鈉（Sigma）、果糖（Sigma）、Androstar?CryoPlus、新鮮卵黃。

1.3 冷凍保護(hù)液配制

Ⅰ組冷凍保護(hù)液配制：首先在1 000 mL的燒杯中準(zhǔn)確倒入770 mL超純水，在磁力攪拌器上攪拌并加熱至34 ℃，此時(shí)緩緩倒入Androstar?CryoPlus基礎(chǔ)稀釋粉，充分?jǐn)嚢枞芙猓芤簆H穩(wěn)定后加200 mL新鮮卵黃并充分?jǐn)嚢枞芙?，向溶液中添?0 mL甘油和5 g乳化劑Equex-Paste，充分?jǐn)嚢枞芙夂笫垢视蜐舛葹?%、乳化劑Equex-Paste濃度為0.5%，作為Ⅰ組冷凍保護(hù)液。

Ⅱ組冷凍保護(hù)液配制：本組冷凍保護(hù)液分為冷卻液A和冷凍液B，主要配制如下：用770 mL超純水溶解Androstar?CryoPlus基礎(chǔ)稀釋粉，34 ℃下充分?jǐn)嚢枞芙?，待溶液pH穩(wěn)定后加200 mL新鮮卵黃并充分?jǐn)嚢枞芙猓〕?00 mL作為冷卻液A；向剩余溶液中添加30 mL甘油和5 g乳化劑Equex-Paste，充分?jǐn)嚢枞芙夂笞鳛槔鋬鲆築，冷凍液B中甘油和乳化劑含量分別為6%和1%。

1.4 精液冷凍處理

1.4.1 Ⅰ組冷凍保護(hù)液冷凍處理（一步稀釋） 檢測(cè)合格的精液使用常溫稀釋液進(jìn)行1～2倍等溫稀釋，梯度降溫至17 ℃，在此溫度下900 g離心20 min，抽棄上清液后添加Ⅰ組冷凍保護(hù)液，調(diào)整精液終密度為8億/mL，充分混勻懸浮后置于5 ℃平衡柜中降溫150 min，使用單頭灌裝機(jī)（MPPUno）灌裝成0.5 mL/支進(jìn)行程序化冷凍，具體降溫曲線如下：5 ℃降至-6 ℃用時(shí)200 s，-6 ℃停留60 s，-6 ℃降至-100 ℃用時(shí)144 s，-100 ℃降至-140 ℃用時(shí)80 s。

1.4.2 Ⅱ組冷凍保護(hù)液冷凍處理（兩步稀釋） 使用Ⅰ組同樣的方法進(jìn)行原精稀釋并17 ℃離心，之后添加冷卻液A，使用移液器懸浮混勻后放置于5 ℃平衡柜中降溫150 min，添加含有甘油和乳化劑Equex-Paste的冷凍液B，調(diào)整精液終濃度為8億/mL，充分渦旋混勻后灌裝成0.5 mL/支，使用與一步稀釋相同的降溫程序進(jìn)行冷凍。

1.5 凍精解凍及精子運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

從液氮罐中取出凍存3 d以上的凍精細(xì)管，迅速放入50 ℃水浴鍋中，水浴解凍16 s，迅速拿出放入到34 ℃水浴中緩孵，使用吸水紙擦干細(xì)管，把管中氣泡輕搖到封口段，在氣泡處剪開，開口向上，翻轉(zhuǎn)細(xì)管把精液流入預(yù)先預(yù)熱至34 ℃的解凍液中，1支冷凍精液加入到8 mL解凍液中，平衡5～20 min，使用IVOS II精子分析儀進(jìn)行精子運(yùn)動(dòng)性能評(píng)估，主要檢測(cè)參數(shù)包括活力（MOT，%）、前向精子（PM，%）、VCL（曲線速度，μm/s）、VSL（直線速度，μm/s）、VAP（平均路徑速度，μm/s）、ALH（精子頭側(cè)擺幅度，μm）、LIN（直線性，%）、STR（前向性，%）及BCF（鞭打頻率，Hz）。

1.6 解凍后精子質(zhì)膜完整性評(píng)估

本試驗(yàn)采用低滲腫脹試驗(yàn)來評(píng)估解凍后精子質(zhì)膜完整性（plasma membrane-intact, PMI），根據(jù)Revell等[6]的方法配制低滲腫脹液，低滲腫脹液（HOST）配制：將0.735 g檸檬酸鈉和1.351 g果糖溶解在100 mL超純水中來制備HOST溶液（滲透濃度約190 mOsmol/kg）。為了評(píng)估精子質(zhì)膜的完整性，解凍后將50 μL精液樣品與500 μL預(yù)熱的HOST溶液混合，并在37 ℃下孵育30 min。溫育后，取1滴精液進(jìn)行400×顯微鏡檢測(cè)。判斷標(biāo)準(zhǔn)：尾部腫脹彎曲的預(yù)示完整的、具有生物學(xué)活性的精子膜，尾部未膨脹彎曲的表明損壞的、無正常生物學(xué)功能的精子膜，見圖1。

圖1 低滲腫脹試驗(yàn)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)先使用Excel處理，再使用SAS 9.2軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

冷凍解凍后精子活力（MOT）、前向精子（PM）、直線速度（VSL）、曲線速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、鞭打頻率（BCF）及質(zhì)膜完整性（PMI）兩組之間差異極顯著（P＜0.01），而解凍后直線性（LIN）、前向性（STR）、精子頭側(cè)擺幅度（ALH）兩組之間差異不顯著（P＞0.05），詳見表1和表2。

表1 解凍后精子活力、前向精子以及運(yùn)動(dòng)速度對(duì)比

表2 解凍后精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)及質(zhì)膜完整性對(duì)比

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，杜洛克精液17 ℃離心后兩步稀釋法的冷凍效果優(yōu)于一步稀釋法，兩步稀釋法凍融后精子運(yùn)動(dòng)性能和質(zhì)膜完整性高于一步稀釋法。路佩瑤等、胡月超、王素梅等分別在絨山羊、公牛和寵物犬上進(jìn)行相似的研究[2-4]，但與本試驗(yàn)不同的是冷凍保護(hù)液里沒有添加OEP類物質(zhì)。

眾所周知，甘油是十分常用的滲透性冷凍保護(hù)劑，但甘油本身也具有一定的細(xì)胞毒性，對(duì)精子毒性的大小與濃度相關(guān)[7]。甘油與精細(xì)胞較長(zhǎng)時(shí)間接觸會(huì)誘導(dǎo)膜的不穩(wěn)定。甘油對(duì)精子提供低溫保護(hù)效果的同時(shí)，由于冷凍的前處理會(huì)對(duì)精子結(jié)構(gòu)造成一定的損害，這種損害目前是不可避免的。在一步稀釋法中甘油與精子接觸時(shí)間較長(zhǎng)，增加了甘油對(duì)精子膜的損傷，本試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。若一步稀釋法中縮短5 ℃平衡時(shí)間，或許會(huì)提高精液冷凍效果。劉興偉等[8]冷凍遼寧絨山羊精液的研究結(jié)果表明，在先用不含甘油的稀釋液進(jìn)行第1次稀釋，在冷凍前再用含甘油的稀釋液進(jìn)行第2次稀釋，其冷凍效果優(yōu)于直接使用含有甘油的一次稀釋法。而吳云海等[9]對(duì)種公牛精液的研究結(jié)果表明，采用一步稀釋法稀釋精液同樣也能達(dá)到比較理想的冷凍效果。這可能是與不同物種的精子對(duì)甘油毒性的耐受程度有關(guān)。

相關(guān)報(bào)道指出，在冷凍稀釋劑中添加乳化劑Orvus ES Paste（OEP）可更好地保護(hù)質(zhì)膜[10]。據(jù)李新紅等[11]研究證明，OEP可使卵黃中的有益成分與犬精子膜更好地相互作用，從而降低冷凍損傷。在含有鴕鳥卵黃和甘油的稀釋劑中添加0.25%和0.50%的OEP可以增強(qiáng)精子凍融后線粒體功能、總運(yùn)動(dòng)性、質(zhì)膜完整性和頂體完整性[12]。Pe?a等[13]認(rèn)為，ESP、OEP等成分具有黏性，對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)中的脂類具有穩(wěn)定作用，可以降低或者阻礙由冷凍保存所引起的似獲能性變化，從而起到保護(hù)質(zhì)膜和頂體的作用。而Pontbriand等[14]猜測(cè)OEP不是直接作用于精子質(zhì)膜，而是通過乳化卵黃中的類脂形成較小聚合體，這些微小的類脂聚合體更有利于維持精子質(zhì)膜的流動(dòng)性，從而達(dá)到保護(hù)作用，這種猜測(cè)還沒有確切的證據(jù)來證明。

本試驗(yàn)與其他類似試驗(yàn)不同的是，同時(shí)控制甘油和OEP分步添加，雖然兩組試驗(yàn)其終濃度保持一致，但兩者對(duì)精子的作用時(shí)間不同，這可能是造成冷凍效果不同的主要原因。本試驗(yàn)采用終濃度0.5%的OEP進(jìn)行兩步稀釋冷凍試驗(yàn)，得到了比較滿意的冷凍效果，這與Fraser等[12]的試驗(yàn)結(jié)果類似。從一步稀釋試驗(yàn)的結(jié)果看，甘油和OEP在17 ℃離心后直接添加對(duì)精液冷凍產(chǎn)生了不利影響，除了甘油本身的毒性所致，還沒有相關(guān)報(bào)道證明是因?yàn)镺EP直接添加所致。根據(jù)相關(guān)報(bào)道精子細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間暴露于經(jīng)SDS處理的卵黃基礎(chǔ)稀釋液中可能對(duì)精子功能產(chǎn)生負(fù)面影響[15-16]，因此可以大膽地猜測(cè)較高濃度的OEP跟精子較長(zhǎng)時(shí)間的接觸也可能會(huì)對(duì)杜洛克精子產(chǎn)生不利影響，這可能是造成第一組試驗(yàn)冷凍效果差的原因之一。

4 結(jié)論

使用本試驗(yàn)冷凍保護(hù)液進(jìn)行公豬精液冷凍，17 ℃離心后采用兩步稀釋法進(jìn)行冷凍后，其解凍后精子活力、前向精子、精子運(yùn)動(dòng)速度和質(zhì)膜完整性等參數(shù)顯著高于一步稀釋組。