前言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。

本文件由中國(guó)輕工業(yè)聯(lián)合會(huì)提出。

本文件由全國(guó)口腔護(hù)理用品標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)牙膏分技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC492/SC1)歸口。

本文件起草單位：廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院、福建愛(ài)潔麗日化有限公司、淮安縱橫生物科技有限公司、杭州皎潔口腔保健用品有限公司、黑龍江省輕工科學(xué)研究院。

本文件主要起草人：王繼才、夏澤敏、李鑫宇、熊小婷、梁文耀、汪毅、聶明霞、稅鈿、吳謙、譚建華、席紹峰、郭長(zhǎng)虹、吳玉鑾、陳萬(wàn)金、丁觀軍、張秀英、王兆鵬、丁愷、路崴。

本文件為首次發(fā)布。

1 范圍

本文件描述了采用高效液相色譜法測(cè)定牙膏等口腔清潔護(hù)理用品中葉綠素銅鈉鹽的含量，包括原理、試劑、儀器和設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、檢出濃度和定量濃度、回收率和精密度，允許差。

本文件適用于采用高效液相色譜法測(cè)定牙膏等口腔清潔護(hù)理用品中葉綠素銅鈉鹽的含量。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 術(shù)語(yǔ)與定義

本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4 原理

試樣經(jīng)70%乙腈水溶液(體積分?jǐn)?shù))提取，離心過(guò)濾后，用高效液相色譜儀測(cè)定葉綠素銅鈉鹽，以保留時(shí)間和紫外光譜圖定性，外標(biāo)法定量。

5 試劑和材料

除另有規(guī)定外，本試驗(yàn)用水均為GB/T 6682中規(guī)定的一級(jí)水。

5.1 葉綠素銅鈉鹽對(duì)照品CAS No:11006-34-1，純度≥98%。

5.2 乙腈：色譜純。

5.3 乙酸：分析純。

5.4 0.5%乙酸水溶液(體積分?jǐn)?shù))：準(zhǔn)確量取5mL乙酸(5.3)至燒杯中，再加入995mL純水，混勻。

5.5 70%乙腈水溶液(體積分?jǐn)?shù))：準(zhǔn)確量取700mL乙腈(5.2)至燒杯中，再加入300mL純水，混勻。

5.6 葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1000μg/mL)：稱取葉綠素銅鈉鹽對(duì)照品(5.1)約10mg(精確至0.01mg)于10mL容量瓶中，用70%乙腈水溶液(5.5)定容至刻度，混勻。

5.7 葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用70%乙腈水溶液(5.5)將葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.6)分別配成一系列濃度為0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

5.8 石英砂： 25～150目。

5.9 微孔濾膜：0.45μm，材質(zhì)為尼龍。

6 儀器和設(shè)備

6.1 高效液相色譜儀：配二極管陣列檢測(cè)器。

6.2 分析天平：精度為0.1mg和0.01mg。

6.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。

6.4 渦旋振蕩器：震蕩速度不低于1500r/min。

6.5 超聲波清洗器：功率不低于250W。

7 分析步驟

7.1 試樣處理

將牙膏試樣擠去20mm后，稱取約1g試樣(精確至0.001g)置于50mL聚丙烯離心管中，加入約1g石英砂(5.8)，再準(zhǔn)確加入70%乙腈水溶液(5.5)20mL，渦旋混勻后超聲提取10min，然后取適量提取液以10000r/min離心5min，上清液經(jīng)0.45μm濾膜(5.9)過(guò)濾，供高效液相色譜測(cè)定。

7.2 液相色譜參考條件

液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：C18柱(4.6mm×150mm，5μm)，或等效色譜柱；

b)流動(dòng)相：乙腈(5.2)+0.5%乙酸水溶液(5.4)，梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；

表1 梯度洗脫程序

c)流量：1mL/min；

d)檢測(cè)波長(zhǎng)：408nm；

e)柱溫：30℃；

f)進(jìn)樣量：10μL。

7.3 測(cè)定

7.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(5.7)注入高效液相色譜儀，在7.2色譜條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葉綠素銅鈉鹽高效液相色譜圖參見(jiàn)附錄A中的圖A.1。

7.3.2 樣品測(cè)定

將按(7.1)處理好的待測(cè)試樣溶液注入高效液相色譜儀，在7.2的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，高效液相色譜圖參見(jiàn)附錄A中的圖A.2。根據(jù)保留時(shí)間和紫外吸收光譜圖定性，葉綠素銅鈉鹽3個(gè)特征峰(峰1：Cu chlorin e6、峰2：Cu chlorin p6和峰3：Cu isochlorin e4)的峰面積加和后采用外標(biāo)法定量。葉綠素銅鈉鹽3個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的紫外吸收光譜圖分別見(jiàn)附錄A中的圖A.3、A.4和A.5。

試樣溶液中葉綠素銅鈉鹽3個(gè)特征峰的響應(yīng)值之和應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過(guò)線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析。

8 結(jié)果計(jì)算

試樣中葉綠素銅鈉鹽的含量X按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X——試樣中葉綠素銅鈉鹽的含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；

c——試樣溶液中葉綠素銅鈉鹽濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；

V——定容體積，單位為毫升(mL)；

f——稀釋倍數(shù)，不稀釋時(shí)為1；

m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。

9 檢出濃度和定量濃度

葉綠素銅鈉鹽的檢出限為4mg/kg； 定量限為10mg/kg。

10 回收率和精密度

在添加濃度20mg/kg～200mg/kg的濃度范圍內(nèi)，方法的回收率在91.4%～102.9%之內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.0%。

11 允許差

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。

附錄A

(資料性)

參考液相色譜圖及紫外吸收光譜圖

葉綠素銅鈉鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽(yáng)性樣品高效液相色譜圖見(jiàn)(圖A.1)和(圖A.2),紫外吸收光譜圖見(jiàn)(圖A.3)、(圖A.4)和(圖A.5)。

標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明:1-Cu chlorin e6；2-Cu chlorin p6；3-Cu isochlorin e4

標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明:1-Cu chlorin e6；2-Cu chlorin p6；3-Cu isochlorin e4

圖A.3 峰1(Cu chlorin e6)紫外吸收光譜圖

圖A.4 峰2(Cu chlorin p6)紫外吸收光譜圖

圖A.5 峰3(Cu isochlorin e4)紫外吸收光譜圖