鄧 亮,趙曉琴,張艷霞,王自潤,柴茂山

(1.山西大同大學,山西 大同 037009;2.山西省大同市食品藥品檢驗檢測中心,山西 大同 037009)

經(jīng)方中半夏的炮制方法為“湯洗”,其具體操作為“用熱水反復將生半夏(鮮半夏)表面的毒性涎滑物質(zhì)清洗干凈”[1]。為了進一步驗證此炮制方法的合理性,本課題擬通過在實驗室對用經(jīng)方中半夏炮制方法制出的“古法制半夏”與現(xiàn)代?中華人民共和國藥典?(簡稱?中國藥典?)炮制方法制出的等量法半夏、姜半夏、清半夏進行有效成分測量,并比較分析,以衡量經(jīng)方中半夏炮制方法是否合理。

2015版?中國藥典?中半夏的含量控制指標是酸堿滴定法檢測總有機酸中琥珀酸的含量,而總有機酸以琥珀酸為主,琥珀酸是半夏的非專屬性成分,規(guī)定不低于0.25%,但半夏硫熏后總有機酸含量會升高,所以2020版?中國藥典?中刪除了半夏總有機酸中琥珀酸的含量測定[2]。目前,現(xiàn)行?中國藥典?中無半夏的質(zhì)量控制指標,缺少專屬性的質(zhì)量控制方法。半夏作為一種常用的中藥,其化學成分豐富,藥理作用廣泛,對半夏的有效成分進行進一步研究,可為探討半夏的藥理作用和安全用藥奠定基礎。有文獻報道,半夏主要含有機酸、生物堿、核苷類、蛋白質(zhì)、多糖等,目前報道的與藥效相關的成分主要有生物堿、有機酸和核苷類,并采用高效液相色譜法(HPLC)測定不同產(chǎn)地半夏藥材中尿苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸和鹽酸麻黃堿5個代表性有效成分的含量[3]。本項目前期研究發(fā)現(xiàn),不同產(chǎn)地、不同加工方式中有效成分的含量差異較大,不能有效控制半夏的質(zhì)量。因此,本實驗將采用分離效能和靈敏度較高的HPLC測定古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏中鳥苷成分的含量,并對分析方法進行驗證,且應用于各半夏炮制品的質(zhì)量評價中,同時對古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏中的鳥苷、腺苷、尿苷、鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、琥珀酸等有效成分進行定性分析,建立其特征圖譜質(zhì)量表征方法,為半夏炮制品的質(zhì)量表征與控制提供方法支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫LC 1260Ⅱ高效液相色譜儀,Shim-Pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,MS105DU電子分析天平(瑞士梅特勒),Practum224-1CN電子分析天平(德國賽多利斯),鼎泰雙頻超聲儀,TG16-WS高速離心機(湖南湘儀)。

1.2 試劑 甲醇為色譜純,對照品購自中國食品藥品檢定研究院,鳥苷對照品批號為111977-201501,含量為93.6%;腺苷對照品批號為110879-200202;尿苷對照品批號為110887-200202;鹽酸麻黃堿對照品批號為171241-201007,含量為99.7%;鹽酸偽麻黃堿對照品批號為171237-201003;琥珀酸對照品批號為110896-201602,供鑒別用。

1.3 藥材飲片樣品 研究用樣品包括古法制半夏、法半夏、姜半夏、清半夏各兩批;生半夏藥材產(chǎn)地為山西夏縣,古法制半夏采用?傷寒雜病論?中半夏的炮制方法“湯洗”炮制而成;法半夏、姜半夏、清半夏均從市場購買。各樣品均經(jīng)大同市食品藥品檢驗檢測中心鑒定,來源為天南星科植物半夏的干燥塊莖。具體炮制方法如下,古法制半夏:取生半夏,趁鮮去皮,用熱水淘洗數(shù)次,至半夏表面的涎滑物質(zhì)清洗干凈,烘干即得。法半夏、姜半夏、清半夏均按照2020版?中國藥典?中方法炮制[2]。

2 方法

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗 色譜柱:島津shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);以甲醇為流動相A,以水為流動相B,進行梯度洗脫(0～3 min,3%A;3～20 min,3%～10%A;20～40 min,10%～70%A;40～50 min,70%A);流速為每分鐘0.8 m L;檢測波長為254 nm;進樣量為10μL;柱溫為30℃。理論塔板數(shù)不應低于5 000。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取鳥苷對照品11.05 mg、腺苷對照品10.25 mg、尿苷對照品10.76 mg,分別置于25 m L容量瓶中,加5%甲醇至25 m L,搖勻,再精密量取1 m L放入20 m L容量瓶中,加5%甲醇至20 m L,搖勻,制成含20.69μg/m L鳥苷溶液,作為對照品溶液。

精密稱取鹽酸麻黃堿對照品10.34 mg、鹽酸偽麻黃堿對照品10.66 mg,琥珀酸對照品10.66 mg,分別置100 m L容量瓶中,加5%甲醇至100 m L,搖勻,制成含103.4μg/m L鹽酸麻黃堿溶液,作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本實驗樣品粉末(過4號篩)約1.0 g,精密稱定,置于100 m L具塞錐形瓶中,精密加水20 m L,密塞,稱定重量,煎煮30 min,放冷,過濾,用水補足減失的重量,搖勻,離心(5 000 r/min)10 min,傾取上清液,過濾,續(xù)取濾液,過微孔濾膜(0.45μm),即得。

2.4 方法學考察(以鳥苷含量進行驗證)

(1)線性范圍考察 精密量取“2.2”項下的鳥苷對照品溶液(20.69μg/m L),用5%甲醇逐級稀釋,得到不同質(zhì)量濃度的鳥苷對照品溶液,在上述色譜條件下進樣分析,回歸方程為Y＝3 816.7X－0.323 2,R＝0.999 9,結(jié)果表明鳥苷在0.041 38～0.413 80μg范圍內(nèi)線性關系良好。

(2)精密度實驗 吸取鳥苷對照品溶液(20.69μg/m L),連續(xù)進樣6次,進樣量為10μL,在上述色譜條件下測定鳥苷峰面積,計算相對標準偏差(RSD)為0.28%,結(jié)果表明精密度實驗符合有關規(guī)定。

(3)穩(wěn)定性實驗 在室溫條件下,取同一供試品(古法制半夏),按“2.3”供試品溶液的制備項下樣品測定方法制備的溶液,分別在放置0、2、4、8、16、24 h后進樣,進樣量為10μL,測定鳥苷峰面積,計算RSD為0.98%,結(jié)果表明鳥苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

(4)重復性實驗 取同一供試品(古法制半夏)樣品,取樣6份,按“2.3”供試品溶液的制備項下樣品測定方法制備測定,進樣量為10μL,做平行實驗,每份進樣2次,記錄鳥苷峰面積,采用外標法計算,鳥苷含量平均值為0.102 5 mg/g,RSD為0.90%,結(jié)果表明重復性實驗符合有關規(guī)定。

(5)加樣回收率實驗(采用加樣回收法) 精密稱取重復性考察測定后已知含量的供試品(古法制半夏)樣品,按“2.3”供試品溶液的制備項下樣品測定方法減半取量,每份約0.75 g,共稱取6份,分別置于100 m L具塞錐形瓶中,再分別精密加入鳥苷對照品溶液(20.69μg/m L)5 m L,按“2.3”項下方法制備,并按以上色譜條件測定,記錄鳥苷峰面積,采用外標法計算回收率,結(jié)果鳥苷平均回收率為102.0%,RSD為1.13%,結(jié)果表明加樣回收率實驗符合有關規(guī)定,見表1。

表1 鳥苷回收率實驗測定結(jié)果

2.5 兩個批次半夏炮制品樣品鳥苷含量測定 對半夏兩個批次的4種不同炮制方法炮制的半夏炮制品樣品,按“2.3”供試品溶液的制備項下制備樣品,按“2.1”色譜條件進樣,經(jīng)HPLC測定各樣品中鳥苷含量,結(jié)果見表2。

表2 兩個批次樣品鳥苷含量測定結(jié)果

2.6 特征峰測定 取各樣品,按“2.3”供試品溶液的制備項下制備樣品,按“2.1”色譜條件進樣測定。

2.7 特征峰指認 標記了10個含量較高且色譜分離效果穩(wěn)定的色譜峰(琥珀酸成分的特征不包含在此特征圖譜中),特征峰采用鳥苷對照品標記其特征峰,鳥苷對照品溶液色譜圖見圖1,腺苷對照品溶液色譜圖見圖2,尿苷對照品溶液色譜圖見圖3,鹽酸麻黃堿對照品溶液色譜圖見圖4,鹽酸偽麻黃堿對照品溶液色譜圖見圖5,琥珀酸對照品溶液色譜圖見圖6。(掃描題目右側(cè)二維碼查看圖片。)

2.8 半夏炮制品特征圖譜結(jié)果 各樣品特征圖譜見圖7—10。(掃描題目右側(cè)二維碼查看圖片。)記錄各峰保留時間,確認保留時間范圍,通過各峰面積值比較,以鳥苷色譜峰(峰5)為參比峰(s)比較各色譜峰相對峰面積情況,見表3。

表3 各樣品特征圖譜峰面積測定結(jié)果

3 結(jié)果

3.1 鳥苷含量測定 古法制半夏平均含量為0.112 5 mg/g,法半夏為0.091 2 mg/g,姜半夏為0.190 5 mg/g,清半夏為0.015 1 mg/g,見表2。

3.2 特征圖譜表征

(1)從圖譜可以看出,經(jīng)過石灰、白礬炮制后的法半夏、姜半夏、清半夏中各成分有所損失,法半夏、姜半夏缺失第3、6、8號峰;清半夏中鳥苷大大減少。古法制半夏各個峰均較顯著,成分損失小,說明古法制半夏的炮制方法對半夏的有效成分保留較多,而且避免石灰、白礬等對人體的毒副作用。

(2)在鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿成分的檢測中對照品有檢出,但各半夏炮制品樣品中均未見鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿色譜峰,可能與鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿不易溶于水且不適合此檢測方法有關。

(3)可能由于琥珀酸含量低,在檢測時,其對照品分別在41.758、43.725、50.000出現(xiàn)了3個峰(見圖6,掃描題目右側(cè)二維碼查看),主峰在41.758;樣品檢測中制半夏、法半夏、清半夏、姜半夏均未檢出琥珀酸成分。分析原因在于半夏總有機酸中琥珀酸含量太低,琥珀酸成分的特征也不包含在上述特征圖譜中。

4 討論

半夏在臨床上廣泛運用于風寒濕痰、胃反嘔吐、瘰疬、腫瘤等病證的治療,但因其有毒,臨床上對其應用須炮制后使用(如法半夏、姜半夏、清半夏等),且用量較小。對于此用法,近代名醫(yī)姜春華認為現(xiàn)代半夏制法均“使半夏失卻藥性,成為淡而無味有名無實的藥渣”[4]。山西名老中醫(yī)李可教授認為現(xiàn)代制半夏藥效較差”[5]。

本課題通過對用經(jīng)方中半夏炮制方法制出的古法制半夏與用現(xiàn)代?中國藥典?中半夏炮制方法制出的法半夏、姜半夏、清半夏進行有效成分測量及比較分析,以衡量經(jīng)方中半夏的炮制方法對于藥物有效成分的保留是否更為合理。

4.1 鳥苷含量分析 古法制半夏生品來源于山西夏縣,自行加工炮制;法半夏、姜半夏、清半夏均從市場購買。由于本課題資金有限,藥材質(zhì)量層次不一,故可能導致檢測用樣品的鳥苷成分含量也不一致,僅憑一種鳥苷成分也不能全面反映半夏各炮制品的內(nèi)外質(zhì)量。為了準確反映各炮制品之間的質(zhì)量差異,本課題組采用HPLC-UV色譜法建立了半夏炮制品特征圖譜表征方法,在已建立的鳥苷含量測定的同時,測定尿苷、腺苷等10個特征峰圖譜。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過石灰、白礬炮制后的法半夏、姜半夏、清半夏中的10個特征峰缺失了第3、6、8號峰;清半夏中鳥苷含量大大減少,其他特征峰也比古法制半夏小;古法制半夏各個峰均較顯著,成分損失小,古法制半夏的炮制方法對半夏的有效成分保留較多,說明經(jīng)方中半夏的炮制方法對于藥物有效成分的保留是合理的。此法操作簡單,重復性好,為半夏炮制品的質(zhì)量控制和評價提供了研究基礎。

4.2 特征圖譜分析 中藥化學成分復雜多樣,不同成分協(xié)同發(fā)揮藥效作用。在質(zhì)量指標成分不明確時,相關文獻也僅限于對某一種或某幾種指標成分進行定量測定,因此本實驗在采用鳥苷含量測定的基礎上,以鳥苷作為質(zhì)量標志物,對半夏中核苷類成分采用HPLC,對不同方法炮制的半夏炮制品中水溶性成分進行色譜峰特征定位表征,同時確定了腺苷、尿苷的特征峰,這樣可解決中藥對照品不易獲得且對多成分含量測定造成局限性的難題,從10個特征色譜峰的保留時間、數(shù)量、位置、大小以評判半夏各炮制品的質(zhì)量優(yōu)劣,從而得出古法制半夏的成分損失最少。

綜合上述水溶性小分子成分的實驗測量結(jié)果分析,經(jīng)方中半夏的炮制方法“湯洗”對于半夏有效成分的保留要優(yōu)于現(xiàn)代法半夏、姜半夏、清半夏的炮制方法,故建議增加古法制半夏的藥典質(zhì)量標準。這種定量與定性相結(jié)合的HPLC特征圖譜表征測量方法操作簡單,重復性好,為半夏炮制品的質(zhì)量控制提供了方法支持,有利于半夏在治療中發(fā)揮更好的作用。由于本課題基金有限,實驗測量中存在樣本數(shù)量少的不足,檢測結(jié)果有待進一步完善與提高,希望能為臨床更合理、有效地使用半夏提供參考依據(jù)。