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單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與表達(dá)分析

2022-06-14 08:08孫彥琳潘會堂張啟翔
關(guān)鍵詞:基序進(jìn)化樹薔薇

孫彥琳,于 超,羅 樂,潘會堂,張啟翔

(1花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室,北京 100083;2國家花卉工程技術(shù)研究中心,北京 100083;3城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室,北京 100083;4園林環(huán)境教育部工程研究中心,北京 100083;5林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室,北京 100083;6 北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,北京 100083)

堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)轉(zhuǎn)錄因子家族,是真核生物中最大、種類最多的家族之一。其特征在于具有高度保守的bZIP結(jié)構(gòu)域,其長度為60~80個氨基酸,由兩部分組成:基本的DNA結(jié)合區(qū)域和亮氨酸拉鏈[1]。目前,bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員已在許多植物基因組中被鑒定,擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有78個[1],水稻(Oryzasativa)中有89個[2],大豆(Glycinemax)中有131個[3],玉米(Zeamays)中有170個[4],蘋果(Malusdomestica)中有114個[5],山茶中有61個[6]。研究發(fā)現(xiàn),bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠調(diào)控植物生長發(fā)育,如葉片[7]、花芽[8-9]和種子的發(fā)育[10-11]。此外,bZIP轉(zhuǎn)錄因子能夠在生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用[12],包括干旱、寒冷、高溫、鹽脅迫以及調(diào)控ABA信號傳導(dǎo)和病原體防御[5]。Liao等[3]發(fā)現(xiàn),大豆中GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78基因是ABA信號的負(fù)調(diào)節(jié)器,在抗鹽和耐凍性方面發(fā)揮作用。近年來,有學(xué)者對蘿卜(Raphanussativus)[13]、柳枝稷(Panicumvirgatum)[14]和紅花(Carthamustinctorius)[15]等植物中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的脅迫響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究。

單葉薔薇(Rosapersica)是薔薇科薔薇屬單葉薔薇亞屬植物,其葉為單葉,花瓣基部有紫紅色斑點(多數(shù)薔薇屬植物為奇數(shù)羽狀復(fù)葉且無花斑),曾被分成一個單獨的屬——單葉薔薇屬(Hulthemia)[16-17]。經(jīng)大量實地調(diào)研證實,該種與《中國植物志》記載的小檗葉薔薇(R.berberifolia)為同一種;且全球公認(rèn)的邱園索引(Index Kewensis)通常將小檗葉薔薇作為單葉薔薇的異名處理。單葉薔薇在我國僅分布于新疆[17],新疆生境條件較為惡劣,當(dāng)?shù)鼗ɑ艽蠖嗑哂锌购?、抗寒、抗風(fēng)、耐鹽堿、耐瘠薄等特點[18]。馮久瑩等[19]對14種新疆野生薔薇屬植物進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)單葉薔薇耐熱性最好?;菘鄣萚18]發(fā)現(xiàn),單葉薔薇對干旱、寒冷、貧瘠有較強(qiáng)的抗性。此外,惠俊愛等[20]還發(fā)現(xiàn),單葉薔薇有典型的旱生結(jié)構(gòu),從解剖學(xué)及細(xì)胞學(xué)角度解析了單葉薔薇的抗旱機(jī)制。本研究對單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行全基因組水平鑒定,并對其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、結(jié)構(gòu)特征、保守基序和順式作用元件等生物信息學(xué)分析,為探究bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族在單葉薔薇生長發(fā)育過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定

單葉薔薇的基因組測序數(shù)據(jù)、基因轉(zhuǎn)錄序列、CDS序列、蛋白質(zhì)序列及其注釋GFF文件來源于本課題組前期研究結(jié)果(未公開)。從蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫Pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/)[21]中下載bZIP域(PF00170)的隱馬爾可夫模型(HMM)配置文件,并通過HMMER軟件搜索蛋白序列(E值<1×10-5),利用NCBI CDD(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)在線工具確認(rèn)bZIP域的完整性。利用DNAMAN軟件進(jìn)行bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的理化性質(zhì)分析,包括蛋白質(zhì)長度、分子質(zhì)量、等電點。通過在線工具WoLF PSORT (http://psort.hgc.jp/)[22]進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。

1.2 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)Dr?ge-Laser等[1]對擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定,從擬南芥數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)下載78條擬南芥bZIP蛋白序列。通過MUSCLE[23]軟件對單葉薔薇和擬南芥bZIP蛋白進(jìn)行多序列比對,并用IQ-TREE軟件[24]構(gòu)建進(jìn)化樹(VT+F+R7,1 000自展值),用iTOL在線軟件[25](https://itol.embl.de)進(jìn)行進(jìn)化樹展示。

1.3 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族保守序列、基因結(jié)構(gòu)和啟動子分析

利用MEME軟件[26]分析單葉薔薇bZIP蛋白保守基序,設(shè)置基序長度為6~200個氨基酸殘基,基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目為10個,其他參數(shù)為默認(rèn)值。通過NCBI CD-Search在線工具對預(yù)測的保守基序進(jìn)行功能注釋(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)。通過單葉薔薇基因組注釋文件獲得基因的結(jié)構(gòu)信息,用TBtools軟件[27]對結(jié)果進(jìn)行可視化處理,繪制保守基序分布和基因結(jié)構(gòu)圖。從單葉薔薇注釋文件中提取bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員起始密碼子上游2 000 bp序列,將序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[28]數(shù)據(jù)庫分析啟動子的順式作用元件。利用Excel繪制順式作用元件數(shù)目統(tǒng)計圖。

1.4 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因定位與共線性分析

使用BLASTp和MCScanX軟件[29]分析基因家族中的重復(fù)事件,通過單葉薔薇基因組GFF文件獲得每個基因的染色體位置信息。利用TBtools軟件[27]對單葉薔薇bZIPs的染色體位置及染色體重復(fù)信息進(jìn)行可視化。

1.5 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族表達(dá)分析

2020年5月,于新疆維吾爾族自治區(qū)呼圖壁縣采集單葉薔薇根、莖、葉片、果實和花5種器官,對其進(jìn)行RNA-seq文庫的構(gòu)建,并利用PacBio測序平臺對構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行測序(由武漢菲沙基因公司負(fù)責(zé)完成),測序獲得的Raw date尚未公布。以RNA-seq數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),以lb(RPKM+1)作為表達(dá)量值,通過TBtools軟件[27]繪制熱圖,分析單葉薔薇bZIPs在不同器官中的表達(dá)譜。另外,根據(jù)差異顯著性分析結(jié)果,分析單葉薔薇12個bZIPs在5種器官中的特異性表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與特征分析

單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基本信息見表1。

表1 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基本信息Table 1 Basic information of bZIP transcription factor family in R. persica

通過使用HMMER分析以及NCBI CDD數(shù)據(jù)庫驗證,共鑒定了50個bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族成員(表1)。bZIP蛋白理化特性分析結(jié)果表明,蛋白質(zhì)長度為149~700 個氨基酸,分子質(zhì)量為17.14~75.47 ku,等電點為4.42~10.72。WoLF PSORT預(yù)測結(jié)果顯示,除Rbe021699定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上外,其余49個bZIP蛋白皆定位在細(xì)胞核。

2.2 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為了探索bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化關(guān)系和分類,使用來自單葉薔薇和擬南芥的bZIP成員氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果見圖1。根據(jù)之前在擬南芥中的研究,將單葉薔薇bZIP蛋白分為12亞族(圖1)。在Dr?ge-Laser等[1]研究的進(jìn)化樹中,ATbZIP72單獨組成M亞族,但是在單葉薔薇與擬南芥共同構(gòu)建的進(jìn)化樹中,ATbZIP72被分入E亞族中。不同亞族單葉薔薇的基因數(shù)目不同,最大的S亞族和A亞族具有9個成員。J亞族不含單葉薔薇bZIP蛋白,推測這些蛋白質(zhì)在單葉薔薇進(jìn)化過程中丟失。

2.3 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族保守序列、基因結(jié)構(gòu)與啟動子分析

單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的基序分布和基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果見圖2。在10個保守基序中(圖2-A),所有的單葉薔薇bZIP蛋白都包含基序1。同一亞族中的bZIP蛋白序列具有相似的保守基序構(gòu)成,例如,基序5和9只存在于A亞族,基序8只存在于F亞族,基序2和3只存在于D亞族,且基序2屬于DOG1結(jié)構(gòu)域。bZIP轉(zhuǎn)錄因子具有不同的功能,這些基序可能發(fā)揮特定的功能。

為了探索單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的基因結(jié)構(gòu),分析每個成員的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu),結(jié)果(圖2-B)表明,同一亞族的成員具有相似的基因結(jié)構(gòu),而不同亞族間結(jié)構(gòu)差異較大。單葉薔薇bZIPs包含1~15個外顯子,在S亞族的9個成員中,有7個沒有內(nèi)含子;Ⅰ亞族均含有4個外顯子。同一亞族中bZIP成員的保守基序組成和基因結(jié)構(gòu)相似,支持了進(jìn)化樹和亞族分類的可靠性。

為了進(jìn)一步研究單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因在非生物脅迫響應(yīng)中的潛在機(jī)制,對其啟動子進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。如圖3所示,分析了5個與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件,分別是ABA響應(yīng)元件(ABRE)、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MBS)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、防御和應(yīng)激反應(yīng)元件(TC-rich repeats)及創(chuàng)傷響應(yīng)元件(WUN-motif)[18]。除Rbe014240和Rbe021919不含此5個元件外,其余bZIPs的啟動子含有1~15個與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件,其中Rbe006639最多(15個),而Rbe002638、Rbe004377、Rbe020114、Rbe025658僅含有1個。有38個單葉薔薇bZIPs(76%)的啟動子含有ABRE元件,表明單葉薔薇bZIP可能對ABA有較強(qiáng)響應(yīng);25個單葉薔薇bZIPs(50%)的啟動子含有LTR元件和MBS響應(yīng)元件,24個(48%)具有WUN-motif響應(yīng)元件,17個單葉薔薇bZIPs(34%)的啟動子具有TC-rich repeats響應(yīng)元件,推測單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因能夠響應(yīng)不同非生物脅迫。

2.4 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的染色體定位和共線性分析

染色體定位結(jié)果(圖4)顯示,除Rbe029759未被錨定在染色體上外,其余49個單葉薔薇bZIPs在7條染色體上分布不均,染色體上的bZIPs數(shù)目與染色體大小無關(guān),最大的5號染色體包含6個基因,6號染色體包含14個bZIPs。使用BLASTp和MCScanX分析了轉(zhuǎn)錄因子家族基因中的重復(fù)事件,僅發(fā)現(xiàn)一對串聯(lián)重復(fù)事件(Rbe002635和Rbe002636)。此外,共鑒定出7個基因?qū)?圖5),這些基因?qū)儆谄沃貜?fù)事件,發(fā)生在7條染色體中的6條上,其中有3對屬于S亞族,其他4對分屬A、C、I、E亞族。

2.5 單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)分析

通過單葉薔薇的RNA-seq數(shù)據(jù),分析單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因在根、莖、葉、花、果實中的表達(dá)譜(圖6)。由圖 6可知,在5個器官中未檢測到Rbe018776的表達(dá),D亞族和E亞族成員整體表達(dá)量較低,Rbe010493、Rbe014412、Rbe006220在5個器官中表達(dá)量都較高。根據(jù)差異顯著性分析的結(jié)果(圖7),某些基因在特定器官中高度表達(dá),Rbe013649在花中特異性表達(dá),Rbe006639和Rbe028637在根中特異性表達(dá),Rbe004215、Rbe028400、Rbe002636、Rbe002635在果實中特異性表達(dá),Rbe011331在葉片中特異性表達(dá)。

3 討 論

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展,許多物種完成了全基因組測序,為功能基因的篩選奠定了基礎(chǔ)。研究[12,30]表明,bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與植物生長發(fā)育的多種生物學(xué)和生理過程,以及對生物/非生物脅迫的響應(yīng)。通過對單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行分析,可為研究該家族在單葉薔薇生長發(fā)育中的作用提供依據(jù)。

本研究共鑒定出50個單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子,與草莓(Fragariavesca,50個)[31]、桃(Prunuspersica,50個)[32]的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族數(shù)量相似,但明顯少于蘋果(Malusdomestica,114)的數(shù)量[5],可能是由于蘋果基因組發(fā)生了全基因組復(fù)制事件而導(dǎo)致了bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族的劇烈擴(kuò)增[33]。將單葉薔薇bZIPs和已知的擬南芥bZIPs共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,并按前人研究[1]分為12亞族。在前人構(gòu)建的擬南芥bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)化樹中,ATbZIP72單獨組成M亞族,但是在本進(jìn)化樹中ATbZIP72被分入E亞族中,可能是建樹模型不同所致。

同一亞族中bZIP成員的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序組成相似,支持了進(jìn)化樹和亞族分類的可靠性。在50個單葉薔薇bZIPs中,有9個(18%)成員沒有內(nèi)含子,與草莓(20%)[31]、蘋果(20%)[34]的比例相似。此外,bZIP轉(zhuǎn)錄因子具有不同的功能,不同的基序可能發(fā)揮特定的功能。對預(yù)測的保守基序進(jìn)行分析,結(jié)果顯示基序2屬于DOG1結(jié)構(gòu)域,與種子的休眠調(diào)控有關(guān)[35],其他基序沒有具體的注釋信息,功能有待闡明。

基因的串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)對于基因家族基因的產(chǎn)生具有重要的作用。單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族重復(fù)基因?qū)χ械?個基因均分布于一個亞族中,且具有相似的外顯子數(shù)量和長度,表明片段或串聯(lián)重復(fù)擴(kuò)大了bZIP 轉(zhuǎn)錄因子家族。片段重復(fù)事件在bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族擴(kuò)張中的貢獻(xiàn)大于串聯(lián)重復(fù)事件[36],在毛白楊[36]、桃[32]的 bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因中分別有72.1%和48%為片段重復(fù)基因。本研究在單葉薔薇5號染色體上發(fā)現(xiàn)一對串聯(lián)重復(fù)基因Rbe002635和Rbe002636,這2個基因均屬于A亞族,基因的結(jié)構(gòu)和基序的組成均極其相似;此外,發(fā)現(xiàn)7對共線性基因?qū)?,片段重?fù)基因約占所有單葉薔薇bZIPs的28%,在單葉薔薇中片段重復(fù)事件數(shù)大于串聯(lián)重復(fù)事件,但是與前人的研究相比所占比率較小。

基因的組織表達(dá)特征與其功能緊密相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),單葉薔薇有3個bZIPs(Rbe010493、Rbe014412、Rbe006220)在5種器官中均高表達(dá),推測其在單葉薔薇的生長發(fā)育過程中發(fā)揮廣泛作用。此外,某些基因在組織中特異性表達(dá),這些基因可能參與單葉薔薇相關(guān)器官的發(fā)育。Rbe013649在花中特異性表達(dá),且相對表達(dá)量較高(2 803.08),屬于H亞族,在進(jìn)化樹中與AtbZIP56(HY5)分于同一小支。研究發(fā)現(xiàn),大部分調(diào)控花青素生物合成的基因和轉(zhuǎn)錄因子受HY5控制[37]。在擬南芥中,HY5不僅能直接調(diào)節(jié)CHS、F3H和F3′H等花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[38],還可以與MYB等轉(zhuǎn)錄因子的啟動子結(jié)合,間接調(diào)控花青素相關(guān)基因的表達(dá)[39]。由此推測,Rbe013649可能調(diào)控單葉薔薇中花青素的合成。此外,干旱脅迫下,根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)是植物生長發(fā)育水平和適應(yīng)外界環(huán)境能力的直接體現(xiàn)[40]。Rbe006639在根中特異性表達(dá),且啟動子中含有15個與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件,可能在單葉薔薇抗旱過程中起重要作用。

4 結(jié) 論

從單葉薔薇基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出50個單葉薔薇bZIPs轉(zhuǎn)錄因子基因,分為12亞族,其中D亞族特有的基序 2屬于DOG1結(jié)構(gòu)域,與種子的休眠調(diào)控有關(guān),該亞族可能具有相關(guān)功能。單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的啟動子含有1~15個與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件,表明單葉薔薇bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族可能響應(yīng)不同的脅迫。檢測到49個bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá),其中Rbe013649在花中相對表達(dá)量較高(2 803.08),可能調(diào)控單葉薔薇中花青素的合成;Rbe006639在根中特異性表達(dá),且含有最多的與非生物脅迫有關(guān)的順式作用元件,可能在單葉薔薇抗旱過程中起重要作用。

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