趙娟 惠雪蓮 祝小妮 陳夢捷 張晴 吉婷

宮頸癌(cervical cancer)是全球第四大常見的女性癌癥[1]。其轉(zhuǎn)移性也導(dǎo)致患者預(yù)后較差，易產(chǎn)生化療耐藥性，中位生存期8～13個(gè)月[2]。研究宮頸癌發(fā)展的分子機(jī)制，可以為其治療提供分子靶點(diǎn)。FK506結(jié)合蛋白14(FKBP14)是一個(gè)免疫親合蛋白亞家族，參與多種生化過程，有研究表明，F(xiàn)KBP14在宮頸癌發(fā)生過程中發(fā)揮癌基因的作用，抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]，但其具體機(jī)制尚不清楚。有報(bào)道顯示，F(xiàn)KBP14在結(jié)腸癌中上調(diào)，通過IL-6/STAT3 通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移[4]。本研究假設(shè)FKBP14通過調(diào)控IL-6/STAT3通路影響宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡，檢測宮頸癌組織及細(xì)胞系中FKBP14的水平，及FKBP14在Hela細(xì)胞中對(duì)存活率和凋亡的影響，以期為宮頸癌靶向治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017年6月至2018年6月于陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院病理檢查確診為宮頸癌的患者手術(shù)切除的宮頸癌組織及癌旁組織(距離腫瘤組織邊緣>2 cm)各30份，年齡22～72歲，平均年齡(48.9±15.1)歲。所有患者術(shù)前未接受放療和化療。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與所有患者簽訂知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人正常宮頸上皮細(xì)胞HUCEC、宮頸癌Hela、SiHa和Caski細(xì)胞購自美國ATCC；RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、JAK-STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490、IL-6蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；CCK8檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；總RNA提取試劑TRIzol、Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自寶生物工程(大連)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；FKBP14、CyclinD1、Cleaved-caspase-3、IL-6、p-STAT3抗體和β-actin抗體購自美國Santa cruz公司；引物、FKBP14過表達(dá)載體(pcDNA3.1-FKBP14)、FKBP14干擾物(si-FKBP14)、陰性對(duì)照(si-NC和pcDNA-NC)載體購自上海吉瑪制藥有限公司；抗體購自美國Santa cruz公司。流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，Real-time PCR儀購自美國Bio-rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):將Hela細(xì)胞接種在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 Real-time PCR檢測FKBP14 mRNA的表達(dá):收集宮頸癌組織、細(xì)胞系Hela、SiHa和Caski，用TRIzol試劑提取組織和細(xì)胞總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照 Real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)合成FKBP14 mRNA，上游引物為：5’-CGCAAGACCAAAGGAGGG-3’，下游引物：5’-TTTTCCATAGCCCAGAGCAG-3’。用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達(dá):收集宮頸癌組織、細(xì)胞系Hela、SiHa和Caski和/或轉(zhuǎn)染后的各組Hela細(xì)胞，破碎組織和細(xì)胞，離心收集蛋白，將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE分離，然后將蛋白條帶轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，洗膜后加入稀釋的一抗(FKBP14抗體：1∶1 000、CyclinD1抗體1∶1 000、Cleaved-caspase-3抗體1∶1 000、IL-6抗體1∶2 000、p-STAT3抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶3 000)，4℃過夜孵育，洗膜，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h，顯影，以β-actin 為內(nèi)參照，分析蛋白表達(dá)水平。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將培養(yǎng)好的Hela細(xì)胞稀釋為1×106個(gè)細(xì)胞/ml，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長融合成單層時(shí)按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)轉(zhuǎn)染物分組：si-NC組和si-FKBP14組，pcDNA-NC組和pcDNA-FKBP14組。將各載體或片段轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 CCK8法檢測細(xì)胞增殖率:收集各組轉(zhuǎn)染或處理后的Hela細(xì)胞，然后以2×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，在培養(yǎng)至48 h時(shí)進(jìn)行CCK8實(shí)驗(yàn)，每孔加入10 μl CCK8溶液，培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測每孔細(xì)胞的OD450 nm(A)值。增殖率(%)=試驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率:收集各組Hela細(xì)胞，以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)48 h，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，按照流式法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 FKBP14 mRNA及蛋白在宮頸癌患者組織中的表達(dá)情況 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與癌旁組織(n=30)組比較，宮頸癌組織組中FKBP14 mRNA和蛋白含量顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測FKBP14蛋白表達(dá)表1 FKBP14 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)

表1 FKBP14 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)

2.2 FKBP14 mRNA及蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，與人正常宮頸上皮細(xì)胞HUCEC組比較，宮頸癌細(xì)胞Hela、SiHa和Caski組中FKBP14 mRNA和蛋白含量顯著升高(P<0.05)。FKBP14在3種細(xì)胞中表達(dá)趨勢一致，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇表達(dá)差異較大的Hela細(xì)胞進(jìn)行。見圖2，表2。

表2 FKBP14 mRNA和蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

圖2 Western Blot檢測FKBP14蛋白表達(dá)表2 FKBP14 mRNA和蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 抑制FKBP14表達(dá)抑制Hela的增殖，促進(jìn)其凋亡 與si-NC組比較，si-FKBP14組Hela細(xì)胞中FKBP14和增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1含量顯著下降，凋亡蛋白Cleaved-caspase-3含量顯著升高，細(xì)胞增殖率降低，細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表3。

圖3 抑制FKBP14對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響；A 流式細(xì)胞儀檢測Hela細(xì)胞凋亡；B Western blot檢測FKBP14、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)

表3 抑制FKBP14對(duì)Hela細(xì)胞存活和凋亡的影響

2.4 FKBP14表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-FKBP14組Hela細(xì)胞中IL-6和p-STAT3含量升高；與si-NC組比較，si-FKBP14組Hela細(xì)胞中IL-6和p-STAT3含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4，圖4。

圖4 Western blot檢測IL-6和p-STAT3蛋白表達(dá)

表4 FKBP14表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 JAK-STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490(50 μmol/L)可以逆轉(zhuǎn)FKBP14對(duì)宮頸癌Hela的增殖、凋亡的影響 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-FKBP14組Hela細(xì)胞中Cyclin D1和p-STAT3含量升高，Cleaved-caspase-3含量降低，細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低；加入JAK-STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490(50 μmol/L)后，與pcDNA-NC組比較，pcDNA-NC+AG490組Hela細(xì)胞結(jié)果相反，細(xì)胞增殖率降低，凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與pcDNA-FKBP14組比較，pcDNA-FKBP14+AG490組Hela細(xì)胞中Cyclin D1和p-STAT3含量升高，Cleaved-caspase-3含量降低，細(xì)胞增殖率升高，凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖5。

表5 JAK-STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490逆轉(zhuǎn)FKBP14對(duì)HeLa細(xì)胞增殖和凋亡的影響

圖5 Western blot檢測p-STAT3、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.6 IL-6蛋白可以逆轉(zhuǎn)si-FKBP14對(duì)宮頸癌細(xì)胞Hela增殖凋亡的影響(100 ng/ml) 用100 ng/ml IL-6蛋白處理轉(zhuǎn)染si-FKBP14的Hela細(xì)胞。結(jié)果表明，與si-NC組比較，si-FKBP14組Hela細(xì)胞中FKBP14和CyclinD1含量降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3表達(dá)升高，細(xì)胞存活率降低而凋亡率升高；si-NC+IL-6組細(xì)胞存活率升高而凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與si-FKBP14組比較，si-FKBP14+IL-6組Hela細(xì)胞中FKBP14和CyclinD1含量升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3表達(dá)降低，細(xì)胞增殖率降低而凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖6，表6。

圖6 Western blot檢測FKBP14、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

表6 IL-6蛋白逆轉(zhuǎn)si-FKBP14對(duì)Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

FKBP14是FK506結(jié)合蛋白(FKBPs)家族成員之一，F(xiàn)KBPs是真核生物中一類高度保守的蛋白質(zhì)，包含一個(gè)或多個(gè)順反肽脯氨酰異構(gòu)酶(PPIase)結(jié)構(gòu)域，參與多種細(xì)胞功能，包括蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)錄等[5-7]。FKBP14通過直接結(jié)合和改變目標(biāo)蛋白的構(gòu)象來激發(fā)其功能，從而起到分子開關(guān)的作用，影響許多人類疾病產(chǎn)前發(fā)育和發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞和分子途徑，其結(jié)構(gòu)域與分子信號(hào)和藥物設(shè)計(jì)密切相關(guān)[8,9]。

FKBP14在胃癌[10]、卵巢癌[11]、骨肉瘤[12]和結(jié)腸癌[4]均表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮癌基因的作用，是胃癌診斷、侵襲和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，可能是卵巢癌的診斷標(biāo)志物和潛在分子靶點(diǎn)。還有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP14在宮頸癌發(fā)生過程中可能通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)運(yùn)動(dòng)而發(fā)揮癌基因的作用，F(xiàn)KBP14有望成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)[3]。本研究檢測30例宮頸癌組織及癌旁組織及宮頸癌細(xì)胞Hela、SiHa和Caski中FKBP14的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FKBP14 的mRNA和蛋白在宮頸癌組織及細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，且在Hela細(xì)胞中抑制FKBP14的表達(dá)可降低細(xì)胞增殖率和Cyclin D1含量，提高細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白含量，與上述研究結(jié)論[3]一致；過表達(dá)FKBP14則結(jié)果相反。

還有研究表明，F(xiàn)KBP14通過靶向IL-6/STAT3信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[4]。IL-6是一種多效性細(xì)胞因子，在腫瘤宿主中大量產(chǎn)生，已有研究表明，IL-6通過激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)產(chǎn)生磷酸化(p-STAT3)，抑制樹突狀細(xì)胞(DC)激活T細(xì)胞的功能成熟，阻止腫瘤免疫的引入，因此阻斷DC中IL-6/STAT3信號(hào)通路和靶分子可能提高癌癥患者免疫治療效果[13-16]。本研究根據(jù)以上研究結(jié)論，假設(shè)FKBP14通過靶向IL-6/STAT3信號(hào)通路調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡。研究結(jié)果表明，過表達(dá)FKBP14可促進(jìn)IL-6/STAT3信號(hào)通路蛋白IL-6和p-STAT3的表達(dá)，下調(diào)FKBP14可抑制IL-6和p-STAT3的表達(dá)；且JAK-STAT3信號(hào)通路抑制劑AG490可以逆轉(zhuǎn)過表達(dá)FKBP14對(duì)宮頸癌Hela的增殖、凋亡的影響；IL-6蛋白(100 ng/ml)可逆轉(zhuǎn)抑制FKBP14對(duì)Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，F(xiàn)KBP14 的mRNA和蛋白在宮頸癌組織及細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，在Hela細(xì)胞中，F(xiàn)KBP14通過靶向IL-6/STAT3信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，提示FKBP14可能是宮頸癌的潛在分子靶點(diǎn)。