曹慧馨，吳迪，王旭升，白洋，吳瓊*，代永剛

（1.長(zhǎng)春大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130022）

黑木耳多糖（Auricularia auricula polysaccharide，AAP）是黑木耳的主要生物活性成分[1]，具有抗氧化、抗凝血、降血糖、降血脂等多種生理活性[2]。然而天然黑木耳多糖由于分子量大，黏度高、水溶性差，難以穿透多個(gè)細(xì)胞膜屏障，無(wú)法進(jìn)入生物體內(nèi)發(fā)揮功能活性[3]，因此，降解黑木耳多糖，制備低分子量多糖，對(duì)提高黑木耳多糖生物活性有重要意義。

降解多糖主要有酶降解法[4-5]、超聲波輔助降解法、化學(xué)降解法[6]，其中化學(xué)降解包括氧化、酸、堿降解。堿降解會(huì)使多糖糖鏈中官能團(tuán)遭到一定程度的破壞，影響多糖抗氧化活性，而氧化降解法中氧化劑對(duì)抗氧化活性的影響較大。本研究利用三氟乙酸優(yōu)化黑木耳多糖降解工藝，以降解黑木耳多糖抗氧化活性為指標(biāo)[7]探究三氟乙酸降解黑木耳多糖條件，得到三氟乙酸降解黑木耳多糖（degradation of Auricularia auricula polysaccharide by trifluoroacetic acid，T-DAAP），以期為分子修飾黑木耳多糖提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三氟乙酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；UV-2700型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津儀器有限責(zé)任公司；NTS-4000B型恒溫振蕩水槽：日本東京理化器械株式會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的提取

采用水提醇沉法[8]提取黑木耳多糖。

1.3.2 多糖的降解

1.3.2.1 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）降解黑木耳多糖單因素試驗(yàn)

以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。5 mg/mL黑木耳多糖溶液于不同三氟乙酸濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mol/L）、不同反應(yīng)時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）、不同反應(yīng)溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）下進(jìn)行水解反應(yīng)。

1.3.2.2 黑木耳多糖降解條件的優(yōu)化

響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)因子與水平Table 1 Response factor and level

1.3.3 黑木耳降解多糖的制備

降解多糖由黑木耳多糖在1.3.2.2優(yōu)化得到的條件下降解，經(jīng)減壓濃縮、透析純化等過程制備。

1.3.4 AAP和T-DAAP組成及結(jié)構(gòu)分析

采用苯酚-硫酸法[10]、考馬斯亮藍(lán)法[11]、間羥基聯(lián)苯法[12]測(cè)定多糖中總糖、蛋白及糖醛酸含量；按GB 5009.4—2016[13]測(cè)定灰分含量；參照陸娟等[14]多糖溶解度測(cè)定方法；采用高效凝膠滲透色譜測(cè)定多糖分子量[15]；采用傅里葉紅外光譜掃描特征吸收峰[16]；采用高效液相色譜測(cè)定多糖單糖組成[17]。

1.3.5 體外抗氧化試驗(yàn)

1.3.5.1 黑木耳降解多糖的DPPH自由基清除試驗(yàn)

2mL樣品加入2mLDPPH-乙醇溶液（0.1mmol/L），搖勻并避光反應(yīng)30 min后測(cè)定517 nm處吸光度[9]。抗壞血酸（VC）做陽(yáng)性對(duì)照，平行試驗(yàn)3次。計(jì)算公式如下。

式中：A1為樣品與DPPH-乙醇溶液測(cè)得的吸光度；A2為樣品與乙醇測(cè)得的吸光度；A0為蒸餾水與DPPH-乙醇溶液測(cè)得的吸光度。

1.3.5.2 羥基自由基清除試驗(yàn)

1 mL樣品加入等量6 mmol/L硫酸亞鐵溶液、6 mmol/L H2O2溶液、6 mmol/L水楊酸溶液，避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測(cè)吸光度[18]。以抗壞血酸做為對(duì)照，按下式計(jì)算清除率。

式中：A1為樣品與硫酸亞鐵溶液、H2O2溶液、水楊酸溶液測(cè)得吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)得吸光度；A0為蒸餾水代替多糖樣品測(cè)得吸光度。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

向15 mL離心管中加入樣品、300 μmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液、936 μmol/L煙酰胺腺嘌呤溶液和120 μmol/L 5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液各1 mL，避光反應(yīng)30 min，在570 nm處測(cè)吸光度。以抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，按下式計(jì)算清除率。

式中：A1為樣品與氯化硝基四氮唑藍(lán)溶液、煙酰胺腺嘌呤溶液、5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液測(cè)得吸光度；A2為蒸餾水代替5-甲基吩嗪硫酸甲酯溶液測(cè)得吸光度；A0為蒸餾水代替多糖樣品測(cè)得吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Execl 2016進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 TFA濃度對(duì)DPPH自由基的清除活性的影響

不同濃度TFA對(duì)DPPH自由基的清除率，試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 TFA濃度對(duì)DPPH自由基清除活性的影響Fig.1 Effect of concentration of TFA on DPPH radical scavenging activity

由圖1可知，TFA濃度在0.2 mol/L～0.8 mol/L，降解多糖對(duì)DPPH自由基的清除率隨降解劑濃度升高呈不斷上升趨勢(shì)，濃度達(dá)0.8 mol/L后，降解多糖DPPH自由基清除率不斷下降，這可能是由于高濃度TFA促使黑木耳多糖降解成更小的結(jié)構(gòu)，黑木耳多糖活性官能團(tuán)遭到破壞，導(dǎo)致DPPH自由基清除活性隨濃度升高降低[19]。

2.1.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除活性的影響

反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH清除活性的影響見圖2。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除活性的影響Fig.2 Effect of reaction time on DPPH radical scavenging activity

由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間由0.5 h延長(zhǎng)至2.0 h時(shí)，降解多糖對(duì)DPPH自由基的清除率由32.23%增加到75.88%，2.0 h后緩慢降低，這可能是因?yàn)檩^長(zhǎng)時(shí)間的降解反應(yīng)加劇多糖降解[20]。

2.1.3 反應(yīng)溫度對(duì)DPPH自由基清除活性的影響

反應(yīng)溫度對(duì)DPPH自由基清除活性的影響見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)DPPH自由基清除活性的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on DPPH radical scavenging activity

由圖3可見，黑木耳降解多糖對(duì)DPPH的清除率在40℃到80℃之間不斷增加，而溫度超過80℃時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折。這可能是由于溫度的升高導(dǎo)致分子運(yùn)動(dòng)加劇，反應(yīng)加速，當(dāng)溫度超過80℃，多糖降解程度增大，大量的單糖隨之產(chǎn)生，使具有DPPH自由基清除活性的低分子量多糖結(jié)構(gòu)被破壞，DPPH自由基清除率有所降低。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取TFA濃度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、反應(yīng)溫度（C）作為自變量，在降解多糖濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基清除率（Y）作為響應(yīng)值，用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，采用Box-Bohnken中心組合設(shè)計(jì)降解反應(yīng)條件，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and test results

續(xù)表2 響應(yīng)面分析方案與試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Response surface analysis scheme and test results

采用Design Expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到回歸方程Y（DPPH自由基清除率/%）=71.82+0.29A+1.67B-2.71C+0.56AB+3.44AC+0.17BC-2.14A2-3.80B2-8.02C2。

方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)差異不顯著。相關(guān)系數(shù)R2為0.940 9，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)R2Adj=0.8648，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)較可靠，該模型擬合度較高，可以用于降解多糖DPPH自由基清除率的理論預(yù)測(cè)。C、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），AC 影響顯著（P＜0.05）。

根據(jù)Design-Expert軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以得出當(dāng)TFA濃度為0.79 mol/L、反應(yīng)時(shí)間為2.11 h、反應(yīng)溫度為78.23℃時(shí)，DPPH自由基清除率72.23%，此時(shí)為最優(yōu)的降解條件。

2.2.2 交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響

各因素交互作用對(duì)降解多糖DPPH自由基清除率的影響見圖4。

圖4 各因素交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of interaction of various factors on DPPH radical scavenging rate

響應(yīng)面坡度越陡峭，表明該交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響越大；反之則表明交互作用對(duì)DPPH自由基清除率的影響越小。在交互項(xiàng)對(duì)提取率的影響中，TFA濃度與反應(yīng)溫度交互作用明顯，與方差分析的結(jié)果一致。

通過上述試驗(yàn)可知，黑木耳多糖的TFA濃度0.79 mol/L、反應(yīng)時(shí)間2.11 h和反應(yīng)溫度78.23℃，2 mg/mL降解多糖對(duì)DPPH自由基清除率的理論值為72.23%。考慮可行性，調(diào)整試驗(yàn)條件為78.2℃下0.8 mol/L TFA降解反應(yīng)2.1 h，得到黑木耳降解多糖對(duì)DPPH自由基的清除率為70.37%，此值與理論值較為接近，所以對(duì)在此條件下得到的黑木耳降解多糖進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 黑木耳多糖和降解多糖的組成及溶解度分析

AAP和T-DAAP的主要成分及溶解度見表4。

表4 AAP和T-DAAP的主要成分及溶解度Table 4 Main components and solubility of AAP and T-DAAP%

降解后多糖的總糖、糖醛酸含量略有降低，蛋白質(zhì)和灰分含量有所升高，這可能是由于三氟乙酸降解后產(chǎn)生部分單糖被透析除去所導(dǎo)致的。多糖溶解度從（38.00±0.30）mg/mL 提升至（51.00±0.20）mg/mL，說(shuō)明黑木耳多糖降解成小分子能夠有效提高其溶解度。

2.4 黑木耳多糖和降解多糖分子量分布

黑木耳多糖和降解多糖分子量分布見圖5。由圖5所示，AAP的保留時(shí)間為9.721 min，T-DAAP的保留時(shí)間為11.009 min，計(jì)算得出AAP分子量為148.2 kDa，T-DAAP分子量為37.5 kDa，說(shuō)明三氟乙酸能夠有效降解黑木耳多糖。

圖5 分子量分布Fig.5 Molecular weight distribution

2.5 黑木耳多糖和黑木耳降解多糖紅外光譜掃描結(jié)果

圖6為AAP和T-DAAP的紅外光譜掃描結(jié)果。

圖6 紅外光譜掃描結(jié)果Fig.6 Infrared spectrum scanning results

從圖6發(fā)現(xiàn)二者譜圖均有多糖類物質(zhì)的特征吸收峰，3 400 cm-1附近為羥基鍵伸縮振動(dòng)吸收峰，2 932 cm-1附近為甲基或次甲基的C-H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰[17]。此外，C=O的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰在1 630 cm-1處，CH的變形振動(dòng)吸收峰1 420 cm-1附近，β-糖苷鍵的特征峰在900 cm-1附近[20]。說(shuō)明降解沒有改變多糖基本結(jié)構(gòu)。

2.6 黑木耳多糖和降解多糖單糖組成

AAP和T-DAAP單糖含量見表5。

表5 AAP和T-DAAP單糖組成Table 5 Monosaccharide composition of AAP and T-DAAP

由表5可知，AAP和T-DAAP主要由甘露糖、葡萄糖和少量的葡萄糖醛酸等組成，降解只改變多糖分子量，其單糖組成及含量未發(fā)生改變。

2.7 體外抗氧化試驗(yàn)

不同濃度樣品對(duì)DPPH自由基清除率的影響見圖7，不同濃度樣品對(duì)羥基自由基清除率的影響見圖8，不同濃度樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除率的影響見圖9。

圖7 不同濃度樣品對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effects of different concentrations of samples on DPPH free radical scavenging

圖8 不同濃度樣品對(duì)羥基自由基的影響Fig.8 Effects of different concentrations of samples on hydroxyl radical

圖9 不同濃度樣品對(duì)超氧陰離子自由基的影響Fig.9 Effects of different concentrations of samples on superoxide anion radical

由圖7～圖9可知，抗壞血酸、AAP、T-DAAP對(duì)DPPH自由基均有清除能力，且T-DAAP清除效果明顯高于AAP。在濃度為10 mg/mL時(shí)，T-DAAP的清除效果與抗環(huán)血酸相近，高達(dá)95.39%，這可能是由于降解使AAP的活性基團(tuán)暴露，提高黑木耳降解多糖清除能力；T-DAAP對(duì)羥基自由基清除能力不及VC，但相比AAP對(duì)羥基自由基清除能力有所提高，且隨著濃度升高而提升，在濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)36.49%；同濃度下超氧陰離子自由基清除率VC＞TDAAP＞AAP，且隨著濃度的升高而升高，在T-DAAP濃度為10 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)66.33%。

3 結(jié)論

試驗(yàn)優(yōu)化了三氟乙酸水解黑木耳多糖工藝。結(jié)果表明，三氟乙酸水解黑木耳多糖的最優(yōu)條件為TFA濃度0.8 mol/L、溫度78.2℃、降解2.1 h，T-DAAP的DPPH自由基清除率為70.37%。降解后多糖溶解度從（38±0.30）%提升至（51±0.20）%，分子量分由 148.2 kDa降低至37.5 kDa，紅外光譜掃描發(fā)現(xiàn)降解未破壞多糖特征官能團(tuán)。T-DAAP的DPPH自由基、羥基自由基清除活性明顯優(yōu)于AAP，表明T-DAAP生物活性得到提高，為黑木耳多糖的分子修飾提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。