王麗萍，王杉，閆彥君，高鳳，張友慧，韓麗君，劉常金

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

馬鈴薯作為中國五大主糧之一，地位僅次于小麥和玉米，其富含維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、微量元素、氨基酸等多種營養(yǎng)物質(zhì)，在鮮切果蔬行業(yè)中有非常廣闊的發(fā)展前景[1]。然而，在其加工運輸過程中，由于存在機(jī)械損傷，容易發(fā)生氧化褐變，使得酚類物質(zhì)被多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）氧化生成醌類物質(zhì)，從而導(dǎo)致馬鈴薯組織黑色素沉積，發(fā)生軟化、變色、失水以及微生物污染等問題，這大大縮短了鮮切馬鈴薯片的保質(zhì)期，致使新鮮度降低，商品價值迅速下降，使得馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也受到很大程度的限制[2]。因此，保持馬鈴薯原有的營養(yǎng)品質(zhì)，預(yù)防其褐變，對于馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[3]。

近年來，對于鮮切果蔬的保鮮主要包括物理保鮮和化學(xué)保鮮等技術(shù)，但這些技術(shù)存在成本高、安全性低的隱患。因此，開發(fā)一種天然無毒、成本低、安全性高的天然抗氧化褐變劑具有重大意義[4]。香椿作為楝科香椿屬木本植物，具有很高的營養(yǎng)價值和生物活性[5]。Peng等[6]研究發(fā)現(xiàn)，香椿葉中含有萜類、苯丙烷類、酚類、蒽醌類、生物堿、苯丙素等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降糖、抗炎等作用。Liu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉含有豐富的黃酮類和三萜類等化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗炎等作用。此外，Guo等[8]研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽中含有原花青素等化合物，具有良好的抗氧化活性和抑菌活性，其抗氧化能力是VC的20倍，被認(rèn)為是目前新型的抗氧化劑之一。吳寧等[9]也發(fā)現(xiàn)，濃度為5 g/L的葡萄籽提取物能夠延長香菇的保質(zhì)期。添加單一的植物提取物，雖然可延長鮮切果蔬的保質(zhì)期，但由于成分單一，保鮮效果不太理想。王佩華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用單一的抗氧化劑時，會出現(xiàn)用量過大的現(xiàn)象，使得抗氧化活性和抑菌效果均不太理想。鄭賀云等[11]發(fā)現(xiàn)生姜提取物、柚皮提取物、荷葉提取物等復(fù)合天然提取物都有一定的防褐變作用，但使用香椿、葡萄籽、山楂葉提取物復(fù)合是否能夠作為馬鈴薯保鮮劑的替代品，目前尚未研究。因此，本研究擬采用香椿葉、山楂葉、葡萄籽提取物為原料，以海藻酸鈉為助劑，通過前期試驗得到復(fù)合抗氧化劑配方，研究復(fù)合抗氧化劑對鮮切馬鈴薯片在儲藏期間的抗氧化活性和抑菌活性的影響，以期為鮮切馬鈴薯貨架期的延長和天然復(fù)合抗氧化劑的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香椿葉：天津科技大學(xué)香椿品種資源庫科研基地；山楂葉提取物：南京草本源生物科技有限公司；葡萄籽提取物：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；馬鈴薯：市售；大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌：天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實驗室。

無水乙醇、碳酸鈉（分析純）：凱馬特（天津）化工科技有限公司；海藻酸鈉、氯化鈣（食品級）：河南萬邦實業(yè)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）（>97%）、2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）（98%）：天津索羅門生物科技有限公司；福林酚：天津為科生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-21高速冷凍離心機(jī)：四川蜀科儀器有限公司；UV-1800紫外風(fēng)光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；FD加熱型冷凍干燥機(jī)：上海欣諭儀器有限公司；IKA RV 8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瓦恩默電器股份有限公司；SB-5200DTD超聲波清洗機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；AIphaCIean 1300超凈工作臺：力康精密科技（上海）有限公司；IS-RDD3恒溫?fù)u床振蕩器：上海予卓儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 香椿葉提取物制備流程

鮮香椿葉→50℃低溫烘干→粉碎、過篩（60目）→按照1∶15（g/mL，60%乙醇溶液）的料液比進(jìn)行3次提取，合并濾液→濃縮凍干→香椿葉提取物。

1.3.2 天然復(fù)合抗氧化劑的制備

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以總色差△E、失重率、PPO和POD活性為考察指標(biāo)，經(jīng)前期試驗確定原料添加比例（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為香椿葉提取物0.11%，山楂葉提取物0.06%，葡萄籽提取物0.011%，海藻酸鈉0.052%。

1.3.3 馬鈴薯預(yù)處理

將新鮮的馬鈴薯經(jīng)過清洗、去皮、切片，分別在濃度為0.05%的香椿葉提取物、山楂葉提取物、葡萄籽提取物、海藻酸鈉以及天然復(fù)合抗氧化劑中浸泡3 min，對照組于蒸餾水中浸泡相同時間。馬鈴薯片自然風(fēng)干后，分裝于自封保鮮袋中，于4℃冰箱儲藏8 d，每隔2 d測定其理化指標(biāo)。

1.3.4 總酚含量的測定

取4g鮮切馬鈴薯，加入10 mL 60%的乙醇溶液，研磨勻漿，于4℃，10 000 r/min的條件下離心10 min，得到樣品粗提液，總酚含量的測定參照Liu等[12]的方法，略作改動，取粗提液0.25 mL，加入0.8 mL濃度為20%的碳酸鈉溶液，再向其中加入0.25 mL的福林酚，混勻，避光反應(yīng)30 min，于760 nm處測定吸光值，總酚含量以每克馬鈴薯中所含的沒食子酸當(dāng)量表示，單位為mg/g。

1.3.5 抗氧化活性的測定

樣品粗提液制備見1.3.4方法。DPPH·清除率的測定參照Wang等[13]的方法，ABTS+·清除率的測定參照Zhao等[14]的方法，略作改動。具體方法：1 mL樣品溶液加入3 mL DPPH溶液，以蒸餾水代替樣品溶液為對照組，于517 nm下測定吸光值。1 mL樣品溶液加入4 mL ABTS工作液，以樣品溶劑代替樣品溶液為對照組，于734 nm下測定吸光值，上述反應(yīng)均避光30 min。

1.3.6 抑菌活性的測定

菌落總數(shù)參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》的方法進(jìn)行測定，對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度測定參照倍比稀釋法[15]進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

全部數(shù)據(jù)均重復(fù)測量3次，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS Statistics 25進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，采用Origin2019進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯保鮮效果的影響

不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯片保鮮效果見圖1。

圖1 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯的保鮮效果Fig.1 Effect of different antioxidants on the preservation of fresh-cut potato

鮮切果蔬的色澤是反映鮮切果蔬褐變程度的關(guān)鍵指標(biāo)。在Zhou等[16]的研究中也發(fā)現(xiàn)，色澤可以直觀的反映出一種食品的質(zhì)量與特性。在對鮮切馬鈴薯片儲藏期的觀察記錄中可以看出，隨著儲藏時間的延長，各試驗組與對照組相比，對鮮切馬鈴薯均有一定的保鮮作用。其中，對照組隨著時間的延長，顏色加深，褐變加重，而天然復(fù)合抗氧化劑試驗組的色澤和亮度均好于單獨處理和對照組。從色澤可以直觀看出，不同處理組對其保鮮效果的程度，由強(qiáng)到弱依次為天然復(fù)合抗氧化劑＞山楂葉提取物＞香椿葉提取物＞海藻酸鈉＞葡萄籽提取物＞對照組。

2.2 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯抗氧化活性的影響

2.2.1 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯總酚含量的影響

酚類化合物作為鮮切果蔬重要的抗氧化物質(zhì)之一，是酶促褐變的主要底物，其含量越高，褐變越嚴(yán)重[17]。不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯總酚含量的影響見圖2。

圖2 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯總酚含量的影響Fig.2 Effect of different antioxidants on total phenols content of fresh-cut potato

由圖2可知，在整個儲藏期間總酚含量整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且試驗組與對照組之間差異顯著（P＜0.05）。在第4天時，總酚含量達(dá)到峰值，后期又逐漸降低，造成此現(xiàn)象的原因可能是由于苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）作為植物體內(nèi)一種重要的防御酶，在馬鈴薯切片過程中受到機(jī)械性損傷時，其防御系統(tǒng)開啟，使得PAL酶活力增加，從而誘導(dǎo)苯丙類化合物向酚類化合物的轉(zhuǎn)化，引起總酚含量的積累[18]。后期由于PPO和POD兩種酶不斷氧化酚類物質(zhì)，使得試驗組馬鈴薯合成酚類物質(zhì)的速率小于PPO和POD氧化酚類物質(zhì)的速率，導(dǎo)致其總酚含量降低[19]。此外，也可能有一部分酚類物質(zhì)被用于保持鮮切馬鈴薯的抗氧化活性。儲藏期間，試驗組總酚含量始終低于對照組，且天然復(fù)合抗氧化劑處理組能夠更好地抑制總酚含量的增加，其中，試驗組保持了較低的總酚含量，這與Liu等[20]的研究結(jié)果一致，可能是試驗組中外源性酚類化合物抑制了馬鈴薯中內(nèi)源性酚類化合物的生成。

2.2.2 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯DPPH·清除率的影響

抗氧化能力的強(qiáng)弱是衡量果蔬貨架期以及生理狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，也是評價果蔬非酶抗氧化活性的常用方法[21]。不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯DPPH·清除率的影響見圖3。

圖3 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯DPPH·清除率的影響Fig.3 Effects of different antioxidants on DPPH·clearance rate of fresh-cut potato

從圖3分析看出，在整個儲藏期間，各試驗組對DPPH·的清除率整體上呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且與對照組相比均有顯著性差異（P＜0.05）。在第4天時，達(dá)到峰值，后期逐漸下降。此結(jié)果與Qiao等[22]的研究一致，其原因可能與不同處理組在儲藏期內(nèi)總酚含量的合成與積累有關(guān)。由于儲藏前期有大量的酚類物質(zhì)被積累，使得DPPH·清除率增強(qiáng)，后期隨著儲藏時間的延長，酚類物質(zhì)被PPO和POD兩種酶不斷氧化，使其含量減少，導(dǎo)致對DPPH·清除率逐漸降低。對照組中，積累的酚類物質(zhì)大多轉(zhuǎn)化為醌類物質(zhì)，加劇了黑色素的生成，使得馬鈴薯褐變加重，抗氧化活性降低。在本研究中，各試驗組均能夠保持較高的DPPH·清除率，且天然復(fù)合抗氧化劑處理能夠更好的保持鮮切馬鈴薯的抗氧化活性。

2.2.3 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯ABTS+·清除率的影響

不同抗氧化劑對鮮切鮮切馬鈴薯ABTS+·清除率的影響見圖4。

圖4 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯ABTS+·清除率的影響Fig.4 Effects of different antioxidants on ABTS+·clearance rate of fresh-cut potato

由圖4可知，相同儲藏時間，各試驗組與對照組之間呈現(xiàn)出顯著性差異（P＜0.05），且均能夠有效地延緩ABTS+·清除率的降低。其中，天然復(fù)合抗氧化劑試驗組對其清除率的延緩效果更佳，能夠較好地保持鮮切馬鈴薯的品質(zhì)。但本研究中，在4 d之前，DPPH·與ABTS+·清除率呈現(xiàn)相反趨勢，這與Sun等[23]的研究結(jié)果相似。此外，Siddiq等[24]研究也發(fā)現(xiàn)相似的現(xiàn)象，可能是因為在溫度、pH值、提取方法以及反應(yīng)的時間等諸多因素的影響下，ABTS+·發(fā)生了一定程度的降解，使得ABTS+·清除率呈現(xiàn)下降趨勢。

2.3 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯抑菌活性的影響

2.3.1 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯菌落總數(shù)的影響

果蔬在鮮切過程中會導(dǎo)致組織損傷，使得微生物大量繁殖，導(dǎo)致鮮切果蔬品質(zhì)下降。因此，菌落總數(shù)是衡量果蔬微生物污染程度的重要指標(biāo)[25]。不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯菌落總數(shù)的影響見圖5。

圖5 不同抗氧化劑對鮮切馬鈴薯菌落總數(shù)的影響Fig.5 Effects of different antioxidants on the total bacterial count of fresh-cut potato

從圖5可以看出，在儲藏期間，各處理組菌落總數(shù)均低于對照組，從第2天起，對照組與試驗組之間差異顯著（P＜0.05），且天然復(fù)合抗氧化劑能夠更好地抑制菌落總數(shù)的增加。這與Wong等[26]的研究結(jié)果一致，可能是由于提取物中多酚、原花青素等活性化合物具有一定的抑菌效果。李曉雁等[27]研究發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉具有一定的成膜性，與其它多糖類物質(zhì)聯(lián)合使用時，可提高膜的強(qiáng)度。天然復(fù)合抗氧化劑試驗組具有抑菌活性成分和海藻酸鈉成膜性的雙重作用，限制了微生物生長所需的條件，能夠更加有效地抑制鮮切馬鈴薯表面微生物的生長。

2.3.2 最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）的確定

不同抗氧化劑對沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度測定見表1～表3。

表1 不同抗氧化劑對沙門氏菌的最小抑菌濃度測定Table 1 Determination of minimum inhibitory concentration of different antioxidants on Salmonella

表2 不同抗氧化劑對大腸桿菌的最小抑菌濃度測定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of different antioxidants on Escherichia coli

表3 不同抗氧化劑對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度測定Table 3 Determination of minimum inhibitory concentration of different antioxidants on Staphylococcus aureus

由表1和表2可知，香椿葉、山楂葉、葡萄籽提取物以及天然復(fù)合抗氧化劑處理對沙門氏菌和大腸桿菌兩種革蘭氏陰性菌均有一定程度的抑制作用。其中，香椿葉、山楂葉、葡萄籽提取物以及天然復(fù)合抗氧化劑處理對沙門氏菌最小抑菌濃度分別為0.031 25、5、0.031 25、0.02 mg/mL；對大腸桿菌的最小抑菌濃度均為0.012 5 mg/mL；整體來說不同抗氧化劑對大腸桿菌的抑制作用較明顯。對于沙門氏菌，山楂葉提取物抑菌效果較差，天然復(fù)合抗氧化劑處理好于香椿葉和葡萄籽提取物。

從表3可知，不同抗氧化劑對金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用。其中，香椿葉、山楂葉、葡萄籽提取物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度相同，均為0.012 5 mg/mL。天然復(fù)合抗氧化劑處理對金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度濃度為0.006 3 mg/mL，抑制效果更佳。且與沙門氏菌相比，各試驗組對于金黃色葡萄球菌的抑制效果更好。

2.3.3 生長曲線的測定

2.3.3.1 大腸桿菌生長曲線的測定

選取濃度為2MIC的各試驗組，研究其對大腸桿生長的影響。不同抗氧化劑對大腸桿菌生長曲線的影響見圖6。

圖6 不同抗氧化劑對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.6 Effects of different antioxidants on the growth curve of Escherichia coli

由圖6可知，與對照組相比，各試驗組均對大腸桿菌的生長有一定的抑制作用。在0～12 h，大腸桿菌生長速率呈現(xiàn)上升趨勢，進(jìn)入對數(shù)期，12 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期。可以看出，加入香椿葉、葡萄籽、山楂葉提取物以及天然復(fù)合抗氧化劑的試驗組均抑制了大腸桿菌的生長速率，且加入天然復(fù)合抗氧化劑對大腸桿菌有更好的抑制作用。此現(xiàn)象與任國媛等[28]的研究結(jié)果相似，說明樣品中的有些物質(zhì)抑制了大腸桿菌的正常生長和繁殖，使得菌體數(shù)量下降，從而達(dá)到一定的抑菌效果。

2.3.3.2 沙門氏菌生長曲線的測定

選取濃度為2MIC的各試驗組，研究其對沙門氏菌生長的影響。不同抗氧化劑對沙門氏菌生長曲線的影響見圖7。

圖7 不同抗氧化劑對沙門氏菌生長曲線的影響Fig.7 Effects of different antioxidants on the growth curve of Salmonella

由圖7可知，各試驗組對沙門氏菌均有一定程度的抑制作用，在0～12 h，沙門氏菌生長進(jìn)入對數(shù)期，12 h之后，進(jìn)入穩(wěn)定期。當(dāng)加入各種抗氧化劑時，沙門氏菌的生長受到一定程度的抑制，不同的試驗組均延緩了沙門氏菌的生長速率。其中，天然復(fù)合抗氧化劑相比于單一抗氧化劑對沙門氏菌有更好的抑制效果。此現(xiàn)象與周倩倩等[29]用異硫氰酸酯類香料處理沙門氏菌的抑菌結(jié)果相似。

2.3.3.3 金黃色葡萄球菌生長曲線的測定

選取濃度為2MIC的各試驗組，研究其對金黃色葡萄球菌生長的影響。不同抗氧化劑對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響見圖8。

圖8 不同抗氧化劑對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響Fig.8 Effects of different antioxidants on the growth curve of Staphylococcus aureus

從圖8中可以看出，加入香椿葉、葡萄籽、山楂葉提取物及天然復(fù)合抗氧化劑均使得金黃色葡萄球菌的生長得到抑制，其抑菌效果由強(qiáng)到弱依次為天然復(fù)合抗氧化劑＞山楂葉提取物＞葡萄籽提取物＞香椿葉提取物＞對照組。整體來說，天然復(fù)合抗氧化劑抑菌效果好于單一抗氧化劑。此抑菌結(jié)果與王巖等[30]研究結(jié)果相似，說明不同試驗組中有抑菌活性物質(zhì)，抑制了金黃色葡萄球菌菌體生長。

3 結(jié)論

本研究中，在儲藏期內(nèi)，試驗組鮮切馬鈴薯片的總酚含量、菌落總數(shù)均低于對照組，且有顯著差異（P＜0.05），并且各試驗組均能夠?qū)Υ竽c桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制，其中，天然復(fù)合抗氧化劑的效果更佳。說明天然復(fù)合抗氧化劑能夠抑制引起馬鈴薯褐變的底物，控制微生物數(shù)量的增加，從而較好地保持鮮切馬鈴薯的色澤和營養(yǎng)物質(zhì)。隨著儲藏時間的延長，不同試驗組的DPPH·和ABTS+·清除率也均高于對照組。其中，天然復(fù)合抗氧化劑能夠更好地保持鮮切果蔬的抗氧化活性。綜上所述，天然復(fù)合抗氧化劑能夠抑制馬鈴薯褐變的相關(guān)底物，減少組織內(nèi)有害物質(zhì)的產(chǎn)生，能夠較好地保持鮮切馬鈴薯片的營養(yǎng)和品質(zhì)。