姚遠(yuǎn) 李占君 賈凱慧 楊逢建

摘 要：為探究水榆花楸中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質(zhì)的最佳提取工藝，為其他化學(xué)成分提取提供參考依據(jù)，以水榆花楸葉片為原料，以表面活性劑十二烷基硫酸鈉水溶液為溶劑，采用超聲輔助提取法提取綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質(zhì)，對(duì)超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，最佳提取工藝為超聲功率405 W、超聲時(shí)間 40 min、超聲溫度60 ℃、液料比20∶1（mL/g）、提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，該條件下綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率分別為2.13%±0.06%、0.54%±0.02%、0.19%±0.02%，與理論預(yù)測(cè)值2.14%、0.54%、0.19%一致。相比索氏提取法，超聲輔助法提取水榆花楸中3種活性物質(zhì)得率略有提高，優(yōu)化所得提取工藝具有高穩(wěn)定性、高得率等特點(diǎn)，應(yīng)用前景較好。

關(guān)鍵詞：水榆花楸;活性物質(zhì);十二烷基硫酸鈉;超聲輔助提取;響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)：TQ645.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1006-8023（2022）03-0087-08

Optimization of Extraction Process of Three Active Substances

from Sorbus alnifolia

YAO Yuan1， LI Zhanjun2， JIA Kaihui1， YANG Fengjian1*

（1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

2.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China）

Abstract：In order to study the extraction technology of chlorogenic acid， rutin and hyperin from the leaves of Sorbus alnifolia， and provide reference for the extraction of other chemical components， the leaves of Sorbus alnifolia were used as raw materials， and the surfactant sodium dodecyl sulfate aqueous solution was used as solvent to extract three active substances， chlorogenic acid， rutin and hyperin by ultrasonic assisted method. Based on five single factor experiments of ultrasonic power， ultrasonic time， ultrasonic temperature， liquid-material ratio and mass fraction of extraction solvent， the Box-Behnken response surface method was designed to optimize the extraction process and verified. Results showed that： the optimum process parameters were determined as follows： ultrasonic power 405 W， ultrasonic time 40 min， ultrasonic temperature 60 ℃， liquid-solid ratio 20∶1（mL/g）， extraction solvent mass fraction 2%. The yields of chlorogenic acid， rutin and hyperin were 2.13%±0.06%， 0.54%±0.02% and 0.19%±0.02%， which was consistent with the theoretical predicted values of 2.14%， 0.54% and 0.19%. Compared with Soxhlet extraction， the yield of three active substances in Sorbus alnifolia was slightly improved. The optimized extraction process has the characteristics of high stability and high yield， and has a good application prospect.

Keywords：Sorbus alnifolia; active substance; sodium dodecyl sulfate; ultrasonic assisted extraction; response surface method

0 引言

水榆花楸（Sorbus alnifolia），別名黃山榆、花楸、楓榆、千筋樹和黏棗子等，為薔薇科（Rosaceae）花楸屬（Sorbus）落葉喬木，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江流域、黃河流域和東北中南部，生長(zhǎng)于環(huán)境濕潤(rùn)的山坡、山溝或山頂混交林或灌木叢中。水榆花楸樹干通直，高可達(dá)20 m;小枝圓柱形，冬芽卵形，先端急尖，外具數(shù)枚暗紅褐色無(wú)毛鱗片;葉片呈卵形或橢圓卵形，先端短漸尖，側(cè)脈直達(dá)葉邊齒尖;葉柄無(wú)毛或微具稀疏柔毛;樹冠圓錐形，秋季葉片轉(zhuǎn)變成猩紅色，為美麗觀賞樹。因其形態(tài)高大且具觀賞價(jià)值，常被種植用來(lái)美化環(huán)境[1]。17589BAA-E2B5-40FB-90F3-838AB5FB2438

近年來(lái)，花楸屬植物的藥用價(jià)值逐步受到關(guān)注[2]，主要是因?yàn)槠渲θ~、花、果實(shí)種子含有較豐富的黃酮類化合物及多種活性物質(zhì)，其中綠原酸、蘆丁和金絲桃苷等活性物質(zhì)具有清熱解毒、消炎、降低膽固醇、抗腫瘤和抗氧化等功效，在藥物研發(fā)方面有重要價(jià)值[3-7]?，F(xiàn)階段，對(duì)花楸屬植物的研究主要是從黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）和百華花楸（Sorbus pohuashanensis）果實(shí)中提取黃酮類物質(zhì)，關(guān)于水榆花楸的活性物質(zhì)提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定等鮮見報(bào)道。

超聲輔助提取是在溶劑萃取法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新興萃取工藝，其克服了蒸氣蒸餾法、索式提取法和回流提取法等傳統(tǒng)提取方法工序繁雜、耗時(shí)長(zhǎng)和損失大[8]等不足，具有成本低、操作簡(jiǎn)便和得率高等特點(diǎn)[9-10]，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷等活性物質(zhì)在植物或藥物中主要采用有機(jī)溶劑直接提取或超聲輔助提取[11-14]。表面活性劑是近年來(lái)興起的提取溶劑，其能夠降低液體表面張力且具有特殊的兩親分子結(jié)構(gòu)，相比有機(jī)溶劑可更大程度使提取物質(zhì)溶解在溶液中，有效提高提取效率[15-18]。鑒于此，本研究以水榆花楸葉片為原料，以表面活性劑十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）水溶液為溶劑，采用超聲輔助法提取綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)，對(duì)超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證，旨在探究水榆花楸中綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)的最佳提取工藝，為其他化學(xué)成分提取提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

水榆花楸葉片采自東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)并經(jīng)專家鑒定;綠原酸、蘆丁、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于等于90%，上海源葉生物科技有限公司;超純水，實(shí)驗(yàn)室自制;磷酸分析純，天津天力化學(xué)試劑有限公司;色譜級(jí)乙腈和甲醇，SK公司;十二烷基硫酸鈉（SDS），天津百倫斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，型號(hào)1260，美國(guó)安捷倫公司;電子分析天平，型號(hào)UH620H，日本SHIMADZU島津;醫(yī)用離心機(jī)，型號(hào)H1650，長(zhǎng)沙市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)器有限公司;數(shù)控超聲清洗機(jī)，型號(hào)JP-100ST，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，型號(hào)DHG-9145A，上海一恒科技有限公司;80目標(biāo)準(zhǔn)篩。

2 ?試驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液制備

水榆花楸葉片置于50 ℃干燥箱內(nèi)干燥24 h，粉碎獲得80目粉末備用。精確稱取1.0 g粉末于50 mL離心管中，加入20 mL，2%十二烷基硫酸鈉水溶液，在不同超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度條件下制備提取液并冷卻至室溫，10 000 r/min高速離心10 min，取0.25 mL上清液加入0.75 mL甲醇稀釋4倍后即為供試品溶液。

2.2 液相色譜條件

Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5SymbolmA@m）。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷檢測(cè)條件：流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.6%磷酸水溶液，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;梯度洗脫，洗脫程序見表1[19]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

將綠原酸、蘆丁、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于甲醇中，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液，用甲醇將母液依次稀釋成6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析，最終得到綠原酸的回歸方程為y=3 726.9x+21.567（R2=0.999 1），線性范圍6.25～200 μg/mL;蘆丁的回歸方程為y=4 484.8x-74.247（R2=0.999 5），線性范圍6.25～200 μg/mL;金絲桃苷的回歸方程為y=5 937.6x-131.68（R2=0.999 0），線性范圍6.25～200 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜如圖1所示。

2.4 供試品得率測(cè)定

將供試品溶液測(cè)得峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算水榆花楸葉片中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率，公式為

Y=（M1/M2）×100%。

式中：Y為活性物質(zhì)得率（%）;M1為提取活性物質(zhì)質(zhì)量算術(shù)平均值，g;M2為水榆花楸葉片粉末質(zhì)量，g。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

采用Origin 2018和Design Expert 10軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理。

2.6 單因素試驗(yàn)

稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40 ℃，液料比20∶1（mL/g），研究超聲功率200、300 、400 、500 、600 W對(duì)得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲功率400 W，超聲溫度40 ℃，液料比20∶1 （mL/g），研究超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min對(duì)得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲功率400 W，超聲時(shí)間30 min，液料比20∶1 （mL/g），研究超聲溫度30、40、50、60、70 ℃對(duì)得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，2%十二烷基硫酸鈉水溶液為提取溶劑，超聲功率400 W，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40 ℃，研究液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 （mL/g）對(duì)得率的影響。稱取干燥水榆花楸葉片粉末1 g，超聲功率400 W，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40 ℃，液料比20∶1 （mL/g），研究十二烷基硫酸鈉水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%、1.6%、2%、2.4%、2.8%對(duì)得率的影響。17589BAA-E2B5-40FB-90F3-838AB5FB2438

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)自變量，設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken Design優(yōu)化試驗(yàn)，以得率為響應(yīng)值，響應(yīng)面因素水平見表2。

2.8 對(duì)比試驗(yàn)

采用索氏提取法進(jìn)行對(duì)比，稱取水榆花楸粉末5.0 g，提取溶劑為70%乙醇溶液，液料比20∶1（mL/g），提取時(shí)間4 h，10 000 r/min離心10 min后取上清液作為待測(cè)溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

圖2為不同因素對(duì)水榆花楸3種活性物質(zhì)得率的影響分析圖。

3.1.1 超聲功率對(duì)得率的影響

由圖2（a）可知，超聲功率從200 W升至600 W，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲功率為400 W時(shí)，得率均達(dá)最大值，超過(guò)400 W后得率開始下降。這是因?yàn)殡S著超聲波機(jī)械震蕩作用逐漸加強(qiáng)，提取溶劑可加速進(jìn)入植物細(xì)胞中，同時(shí)超聲波的空化效應(yīng)促進(jìn)葉片組織完全分解破裂，使細(xì)胞內(nèi)容物完全釋放溶出，且強(qiáng)烈的超聲波熱效應(yīng)產(chǎn)生更高熱量，使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的溶解度增大[20];隨著超聲功率繼續(xù)增大，大部分雜質(zhì)溶解，影響提取物質(zhì)溶解度，導(dǎo)致得率下降。綜合考慮，選取300～500 W 超聲功率進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

3.1.2 超聲時(shí)間對(duì)得率的影響

由圖2（b）可知，綠原酸活性物質(zhì)得率在超聲時(shí)間10～20 min先下降，20～40 min再升高，40～50 min再下降;超聲時(shí)間從10 min 升至50 min，蘆丁和金絲桃苷2種活性物質(zhì)得率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，得率均達(dá)最大值，超過(guò)40 min后得率開始下降。這是因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)短，提取溶劑與葉片粉末未達(dá)到完全浸潤(rùn)[21]，細(xì)胞破碎程度小，活性成分無(wú)法擴(kuò)散到提取溶劑中;隨著超聲時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，活性物質(zhì)被部分氧化和分解，導(dǎo)致得率下降[22]。綜合考慮，選取30～50 min超聲時(shí)間進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

3.1.3 超聲溫度對(duì)得率的影響

由圖2（c）可知，超聲溫度從30 ℃升至70 ℃，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時(shí)，得率均達(dá)最大值，超過(guò)60 ℃后得率開始下降。這是因?yàn)槌暅囟壬?，可加快分子擴(kuò)散速率，促進(jìn)活性物質(zhì)析出[23];隨著超聲溫度繼續(xù)升高，溶劑部分揮發(fā)，導(dǎo)致得率下降。綜合考慮，選取50～70 ℃超聲溫度進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

3.1.4 液料比對(duì)得率的影響

由圖2（d）可知，液料比從10∶1（mL/g）升至30∶1（mL/g），綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率呈先升高后緩慢下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)橐毫媳容^小，提取溶劑不能完全浸潤(rùn)材料，活性物質(zhì)無(wú)法完全提取出來(lái) [21];當(dāng)液料比達(dá)20∶1（mL/g）時(shí)，葉片粉末與提取溶劑的接觸面積增大，促進(jìn)活性物質(zhì)析出;液料比進(jìn)一步增大，溶質(zhì)全部溶解，其他物質(zhì)溶出[24]，導(dǎo)致得率下降。綜合考慮，選取20∶1 （mL/g）液料比進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

3.1.5 提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

由圖2（e）可知，提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)從1.2%升至2.8%，綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，得率均達(dá)最大值。這是因?yàn)榫G原酸等活性物質(zhì)極性較弱，適當(dāng)增加表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)可降低溶劑極性，有利于活性物質(zhì)溶出;但隨著表面活性劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，對(duì)活性物質(zhì)的增溶作用不再增強(qiáng)，溶液中形成的膠束處于飽和狀態(tài)，活性物質(zhì)進(jìn)入膠束溶出受到阻礙[25]，導(dǎo)致得率下降后趨于平緩。綜合考慮，選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的十二烷基硫酸鈉水溶液進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

3.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)三因素三水平Box-Behnken Design優(yōu)化試驗(yàn)，見表3，對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得：

綠原酸得率回歸方程為Y1（%）=2.14-0.02A+4.43×10-3B+5.90×10-3C+1.61×10-3AB+0.01AC+1.69×10-3BC-0.11A2-0.09B2-0.08C2;

蘆丁得率回歸方程為Y2（%）=0.54+0.01A+4.87×10-3B+0.01C+5.35×10-3AB-2.10×10-3AC+6.36×10-4BC-0.04A2-0.09B2-0.06C2;

金絲桃苷得率回歸方程為Y3（%）=0.19+2.40×10-3A+1.21×10-3B+1.87×10-3C+1.52×10-3AB+4.55×10-4AC+5.05×10-5BC-5.64×10-3A2-0.01B2-0.01C2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，由表4可知，3個(gè)模型F分別為48.51、39.03、27.71，P均小于0.01，說(shuō)明模型差異極顯著，其中A2、B2、C2對(duì)綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率影響極顯著，A對(duì)3種活性物質(zhì)得率影響顯著，C對(duì)蘆丁得率影響顯著，其他因素二者之間的交互作用均不顯著。失擬項(xiàng)P分別為0.05、0.05、0.06，表明差異不顯著，模型計(jì)算所得得率與試驗(yàn)值無(wú)明顯差異。對(duì)多項(xiàng)式進(jìn)行回歸分析，決定系數(shù)（R2）分別為0.984 2、0.980 5、0.972 7，校正系數(shù)（Adj. R2）分別為0.963 9、0.955 3、0.937 6，均大于 0.90，見表5，表明模型擬合度良好，響應(yīng)面適合后續(xù)優(yōu)化。

3.2.2 因素交互影響及等高線分析

由圖3可知，各因素之間交互作用對(duì)水榆花楸中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷3種活性物質(zhì)影響的響應(yīng)面均為向下曲面，曲面越陡，表明交互作用越明顯，隨著各因素參數(shù)值增大，得率呈先增大后減小的趨勢(shì)。響應(yīng)面底部為等高線投影，圖3（a）、圖3（b）等高線為橢圓形，圖3（c）等高線近乎圓形，表明綠原酸AB、AC的交互作用比BC的交互作用顯著;圖3（d）等高線橢圓形扁平程度最大，表明蘆丁AB的交互作用最顯著;圖3（g）等高線為橢圓形，表明金絲桃苷AB的交互作用最顯著，與表4方差分析結(jié)果一致。17589BAA-E2B5-40FB-90F3-838AB5FB2438

3.2.3 優(yōu)化提取參數(shù)和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)回歸模型分析可知，最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率405.64 W、超聲時(shí)間40.35 min、超聲溫度60.78 ℃，該條件下綠原酸得率為2.14%、蘆丁得率為0.54%、金絲桃苷得率為0.19%?？紤]到試驗(yàn)可操作性以及儀器精密度，調(diào)整參數(shù)為超聲功率405 W、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度60 ℃。利用調(diào)整后的最佳提取工藝進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)，綠原酸得率為2.13%±0.06%、蘆丁得率為0.54%±0.02%、金絲桃苷得率為0.19%±0.02%，與理論預(yù)測(cè)值吻合度較高，表明優(yōu)化后的條件切實(shí)可行。

3.2.4 對(duì)比試驗(yàn)

對(duì)比表6中2組數(shù)據(jù)可知，相比較索氏提取法，表面活性劑結(jié)合超聲輔助提取法優(yōu)化的提取工藝3種活性物質(zhì)得率均有提高，且具有操作簡(jiǎn)單、提取時(shí)間短、耗能少的優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論與討論

本研究將表面活性劑與超聲輔助提取方法相結(jié)合，以水榆花楸葉片為原料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化分析，確定最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率405 W、提取時(shí)間40 min、超聲溫度60 ℃、液料比為20∶1（mL/g）、提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，該條件下綠原酸、蘆丁和金絲桃苷3種活性物質(zhì)得率分別為2.13%±0.06%、0.54%±0.02%、0.19%±0.02%，與理論預(yù)測(cè)值2.14%、0.54%、0.19%一致，遠(yuǎn)高于孟令鍇等[1]測(cè)定百華花楸果實(shí)中的金絲桃苷和蘆丁得率，金絲桃苷得率是其10倍，蘆丁得率是其5倍。相比索氏提取法，超聲輔助法提取水榆花楸中3種活性物質(zhì)得率略有提高，優(yōu)化所得提取工藝具有高穩(wěn)定性、高得率等特點(diǎn)，應(yīng)用前景較好。

【參 考 文 獻(xiàn)】

[1]孟令鍇，張朝立，高長(zhǎng)久，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定百華花楸果實(shí)中金絲桃苷和蘆丁的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，13（4）：32-35，40.

MENG L K， ZHANG C L， GAO C J， et al. HPLC determination of content of hyperoside and rutin in fruit of Srobus pohuashanensis[J]. China Medical Herald， 2016， 13（4）： 32-35，40.

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