吉曉理 呂有凱 羅江賓 吳松巖

(1三亞市人民醫(yī)院，海南 三亞 572000；2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院)

冠心病的發(fā)生是糖尿病、高血壓、高脂血癥等多種危險因素共同作用的結(jié)果，中老年人為冠心病的多發(fā)群體。冠狀動脈血管壁炎癥反應(yīng)可激活血小板黏附，促進血管內(nèi)免疫細胞的聚集，導(dǎo)致動脈硬化斑塊的形成與破裂，出現(xiàn)血管閉塞，是心絞痛、心肌梗死發(fā)生的病理基礎(chǔ)之一〔1〕。Toll樣受體(TLR)參與調(diào)控人體免疫應(yīng)答過程，能夠識別外來病原體并啟動相關(guān)防御機制〔2〕。相關(guān)研究顯示，急性冠狀動脈綜合征大鼠模型中TLR發(fā)揮免疫調(diào)控作用〔3〕。Notch信號通路參與細胞間信號傳導(dǎo)過程，與組織器官發(fā)育和分化密切相關(guān)〔4〕；Notch信號通路還能夠調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化和侵襲〔5〕。本研究分離培養(yǎng)中老年冠心病患者外周血單個核細胞，進一步分選出CD14+單核細胞，探討冠心病病情發(fā)展中Notch信號通路與TLR4的相互作用。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年7月至2020年2月三亞市人民醫(yī)院收治的中老年冠心病患者128例。入選標準：①年齡≥45歲，有胸痛、心悸、乏力等典型的冠心病臨床癥狀，經(jīng)冠狀動脈造影確診為冠心??；②無溝通障礙，自愿參與本研究。排除標準：合并精神性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤的患者。其中男71例，女57例，年齡46～71歲；根據(jù)病情分為心絞痛組86例，男48例，女38例，平均(53.75±10.04)歲；心肌梗死組42例，男23例，女19例，平均(54.31±10.85)歲。選取55例健康志愿者為正常對照組，男31例，女24例；年齡47～69歲，平均年齡(53.72±9.40)歲。性別、年齡在各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(批號：LDK2018016)，患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑 胎牛血清、人外周血淋巴細胞分離液試劑盒均購于北京杰輝博高生物有限公司；CD14免疫磁珠分選試劑盒購于天津生物芯片技術(shù)有限公司；Notch信號通路抑制劑DAPT、TLR4激動劑CRX-675均購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；PCR檢測試劑盒購于上海代軒生物有限公司；白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測試劑盒購于上海研域化學(xué)試劑有限公司；兔抗人TIR結(jié)構(gòu)域接頭分子(TRIF)、抗髓樣分化因子(MyD)88、磷酸化核因子(NF)-κB p65亞基單克隆抗體，鼠抗人β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗均購于北京拜爾迪生物有限公司。

1.3方法

1.3.1外周血單個核細胞分離 心絞痛患者、心肌梗死患者入院次日，正常對照組健康志愿者體檢時，采集空腹肘靜脈血12 ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，進行聚蔗糖(FICOLL)密度梯度離心，收集外周血單個核細胞，滴加含10%二甲基亞砜(DMSO)的胎牛血清，液氮冷凍后用于后續(xù)實驗。

1.3.2冠心病患者外周血單個核細胞中CD14+單核細胞分離與刺激培養(yǎng) CD14免疫磁珠分選試劑盒分選心絞痛患者和心肌梗死患者外周血單個核細胞中的CD14+單核細胞。向24孔板中加入分選得到的CD14+單核細胞，1×105個/孔，設(shè)置6個復(fù)孔。分別加入終濃度80 μmol/ml的DAPT干預(yù)培養(yǎng)基、300 ng/ml的CRX-675干預(yù)培養(yǎng)基、DAPT與CRX-675共同干預(yù)培養(yǎng)基，均為2個復(fù)孔。其中DAPT與CRX-675共同干預(yù)培養(yǎng)基先后加入終濃度為300 ng/ml、80 μmol/ml的CRX-675、DAPT。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各培養(yǎng)孔中的CD14+單核細胞和培養(yǎng)液。

1.3.3實時定量-PCR檢測Notch2、Notch3、TLR及人內(nèi)皮抑素(HES)2、HES4 mRNA表達 Trizol法提取外周血單個核細胞和CD14+單核細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，Notch2、Notch3、TLR、β-actin引物序列均參考相關(guān)文獻報道〔6〕；HES2、HES4引物序列由南京信帆生物有限公司設(shè)計合成，HES2上游引物：5′-CCGTCATTAGCCGACTCAATC-3′，下游引物：5′-CTCATGTAGTGCCAGCACGAG-3′；HES4上游引物：5′-GAGAGTCATACGCATTACCGATCG-3′，下游引物：5′-CGAACCTGCCATACGTGGACCATA-3′。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性40 s，55℃復(fù)性40 s，共35個循環(huán)，72℃終末延伸3 min。檢測各基因相對表達量。

1.3.4細胞培養(yǎng)液中IL-6、TNF-α表達水平檢測 取心絞痛組和心肌梗死組CD14+單核細胞培養(yǎng)液，收集上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗測定細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α表達水平。

1.3.5Western印跡檢測TRIF、MyD88、NF-κB p65蛋白表達 收集心絞痛組和心肌梗死組CD14+單核細胞，高效RIPA組織細胞裂解液提取總蛋白，定量后取其中10 μg蛋白行電泳，將分離出的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h。洗膜后加入1∶500倍稀釋的兔抗人TRIF單克隆抗體、1∶300倍稀釋的兔抗人MyD88單克隆抗體、1∶1 000倍稀釋的兔NF-κB p65單克隆抗體、1∶2 000倍稀釋的鼠抗β-actin單克隆抗體，4℃過夜，洗滌后加入1∶2 000稀釋的HRP標記二抗，室溫搖床孵育2 h，化學(xué)放光法成像，使用Image進行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS24.0進行χ2檢驗、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組Notch2、Notch3 mRNA表達水平比較 心肌梗死組和心絞痛組外周血單個核細胞中Notch2 mRNA表達水平明顯高于正常對照組，心肌梗死組明顯高于心絞痛組(均P<0.05)。Notch3 mRNA表達水平在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.23組TLR表達水平比較 心肌梗死組和心絞痛組外周血單個核細胞中TLR2、TLR4 mRNA表達水平明顯高于正常對照組，心肌梗死組明顯高于心絞痛組(P<0.05)。TLR1、TLR3、TLR5 mRNA表達水平在各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3Notch信號通路抑制劑對CD14+單核細胞中TLR2、TLR4表達的影響分析 干預(yù)后，心肌梗死組和心絞痛組CD14+單核細胞中TLR4 mRNA表達水平明顯低于干預(yù)前(P<0.01)。Notch信號通路抑制劑干預(yù)后心肌梗死組與心絞痛組CD14+單核細胞中TLR2 mRNA表達水平與干預(yù)前相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 Notch信號通路抑制劑干預(yù)前后兩組TLR2、TLR4 mRNA相對表達量比較

2.4TLR4激動劑對CD14+單核細胞中Notch信號通路的影響分析 干預(yù)后，心肌梗死組和心絞痛組CD14+單核細胞中Notch2、HES2、HES4 mRNA表達水平明顯高于干預(yù)前(P<0.01)；干預(yù)前、后心肌梗死組均顯著高于心絞痛組(均P<0.01)。見表3。

2.5Notch信號通路抑制劑對TLR4介導(dǎo)的炎癥信號通路的影響 TLR4激動劑CRX-675干預(yù)后心肌梗死組和心絞痛組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平明顯高于干預(yù)前(P<0.05)；Notch信號通路抑制劑DAPT與TLR4激動劑CRX-675共同干預(yù)后心肌梗死組和心絞痛組細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平明顯低于TLR4激動劑CRX-675單獨干預(yù)，但仍顯著高于干預(yù)前(P<0.05)。見表4。

2.6Notch信號通路抑制劑對TLR4介導(dǎo)的下游信號因子表達影響分析 Notch信號通路抑制劑DAPT與TLR4激動劑CRX-675共同干預(yù)后心肌梗死組和心絞痛組CD14+單核細胞中TRIF、NF-κB p65蛋白表達水平明顯低于TLR4激動劑CRX-675單獨干預(yù)(P<0.01)。見表5、圖1。

1～4：心絞痛組CRX-675干預(yù)，心絞痛組DAPT+CRX-675干預(yù)，心肌梗死組CRX-675干預(yù)，心肌梗死組DAPT+CRX-675干預(yù)圖1 Western印跡檢測兩組TRIF、MyD88、NF-κB p65蛋白表達

3 討 論

Notch和TLR信號通路參與感染性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展〔7〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路在冠心病患者中調(diào)控血管內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)化和功能缺失〔8〕，還能夠誘發(fā)血管內(nèi)皮細胞凋亡和促炎因子的活化〔9〕。下調(diào)Notch信號通路可能成為冠心病治療的新靶點。目前關(guān)于冠心病患者外周血單個核細胞和免疫細胞中Notch信號通路相關(guān)因子的表達特點及作用仍鮮有研究報道。本研究結(jié)果提示冠心病患者外周血單個核細胞中Notch2高表達，且表達水平隨病情嚴重程度的增加逐漸提升。研究發(fā)現(xiàn)，正常生理狀態(tài)下和病理狀態(tài)下內(nèi)皮細胞來源的Notch2能夠調(diào)控人體固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答〔10〕。而免疫細胞來源的Notch2在冠心病發(fā)生與進展中的作用仍需進一步闡明。本研究結(jié)果提示冠心病患者體內(nèi)Notch2和TLR4相互作用可能共同調(diào)控CD14+單核細胞功能，參與冠心病的病情發(fā)展。

相關(guān)研究顯示，TLR能夠調(diào)控哺乳動物體內(nèi)的炎癥應(yīng)答〔11〕；TLR1、TLR4、TLR5基因缺陷的小鼠中動脈粥樣硬化相關(guān)的炎癥反應(yīng)被抑制，TLR1、TLR4、TLR5能夠上調(diào)活動性斑塊中Wnt5a基因表達，增強炎癥應(yīng)答的強度〔12〕。研究顯示，TLR4與中性粒細胞能夠協(xié)同參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和血管細胞凋亡，影響平滑肌細胞活性，參與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生與發(fā)展〔13〕。本研究結(jié)果提示Notch2與TLR4相互作用可能參與心絞痛和心肌梗死的病理過程。Notch2與TLR4共同調(diào)控冠心病患者體內(nèi)炎癥因子分泌。相關(guān)研究顯示，TLR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路可通過MyD88依賴與非依賴兩種途徑調(diào)控NF-κB磷酸化，加速炎癥因子的合成與分泌，參與免疫應(yīng)答過程〔14〕。本研究結(jié)果顯示，Notch信號通路抑制劑DAPT能夠通過影響冠心病患者CD14+單核細胞中TLR4調(diào)控的TRIF、NF-κB p65表達，對MyD88表達影響不明顯。提示中老年冠心病患者病情發(fā)展中Notch2與TLR4可能通過MyD88非依賴性途徑調(diào)控CD14+單核細胞功能，影響炎癥水平。