祝啟張，劉莉彬，胡 珊，韓孟婷，鄧 輝

（1. 皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽六安 237012；2. 安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽六安 237012）

木瓜蛋白酶是一種水解蛋白酶，具有較強(qiáng)的水解蛋白能力，番木瓜果實(shí)的新鮮乳汁中就含有木瓜蛋白酶，具備凝乳、蛋白合成等多項(xiàng)功能，在生產(chǎn)方面也得到普遍的運(yùn)用[1]。但對(duì)比二者的穩(wěn)定性，游離的木瓜蛋白酶沒(méi)有固定的木瓜蛋白酶好，使用后，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)相比固定化酶來(lái)說(shuō)，游離酶更難分離提煉出來(lái)，傳統(tǒng)的酶固定化載體又存在很多問(wèn)題，因而對(duì)酶的固定化優(yōu)化進(jìn)行了海量的探討和研究。

Fe3O4磁性納米顆粒是當(dāng)代發(fā)展起來(lái)作為酶固定化的優(yōu)良新型載體材料。對(duì)比以前用的酶載體材料，經(jīng)Fe3O4磁性納米顆粒固定化后的蛋白酶更容易被提煉分離出來(lái)，并重復(fù)使用以節(jié)約成本，并且固定化酶在反應(yīng)體系中的運(yùn)動(dòng)軌跡、方向及方式方法可以通過(guò)場(chǎng)外施加磁場(chǎng)來(lái)控制，解決了很多以前機(jī)械攪拌所造成的一系列問(wèn)題，必將在日后酶固定化技術(shù)的應(yīng)用中得到廣泛關(guān)注[2]。為此，以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)已制備所得的Fe3O4磁性納米材料作為酶的固定化載體，探討Fe3O4磁性納米材料固定化木瓜蛋白酶會(huì)對(duì)木瓜蛋白酶產(chǎn)生哪些影響，并對(duì)Fe3O4磁性納米材料固定化木瓜蛋白酶的最適溫度、最適溫度下酶的熱穩(wěn)定性及各種固定化處理后酶的酶活保留率進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

硫酸亞鐵，無(wú)錫市展望化工試劑有限公司提供；氯化鐵、三氯乙酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；濃鹽酸，上海振企化學(xué)試劑有限公司提供；氫氧化鈉，西隴化工股份有限公司提供；木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司提供；酸水解酪氨酸、L-半胱氨酸，上海源聚生物科技有限公司提供；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸，上海試劑一廠提供；海藻酸鈉、氯化鈣，均為分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供。

1.1.2 儀器

UV-5500 型紫外分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；DK-8D 型三孔三溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī)，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；H2050R 型醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；磁鐵，蘇州龍順磁鐵有限公司產(chǎn)品。

1.2 磁性顆粒的合成方法

四氧化三鐵磁性納米顆粒通過(guò)化學(xué)共沉淀法合成[3]，將50.0 mmol 的Fe3O4和100.0 mmol FeCl3和100.0 mL，0.06 mol/L 的HCl 溶液于燒杯中相溶在一起。待溶液呈黃褐色透明狀后，在25 ℃下，再用玻璃棒強(qiáng)烈的攪動(dòng)，將配置好的1.5 mol/L 氫氧化鈉溶液細(xì)心地倒入上述混合液中，待燒杯中的混合溶液的顏色發(fā)生變化，由黃褐色轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏?。在室溫下放置大約30 min，將水浴鍋中水的溫度升至70 ℃，將溶液放置在水浴鍋中進(jìn)行水浴晶體化2 h。用磁鐵將Fe3O4磁性納米顆粒吸附在燒杯的底部，用去離子水清洗多次之后，即可得到磁性納米顆粒。

1.3 固定化木瓜蛋白酶的制備

準(zhǔn)確稱取10 g Fe3O4磁性納米顆粒加入1.5 mg/mL木瓜蛋白酶溶液1 L，pH 值7，溫度為50 ℃條件下在水浴鍋中緩慢振蕩反應(yīng)30 min 后，用磁鐵吸附分離Fe3O4磁性納米顆粒于燒杯底部，傾倒燒杯上層的液體， 經(jīng)過(guò)干燥就可得到Fe3O4磁性納米顆粒，用去離子水清洗數(shù)次，以完全洗去未經(jīng)吸附的游離木瓜蛋白酶，所得到的Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶用于后續(xù)試驗(yàn)操作[4]。

1.4 酶活測(cè)定

酶活的定義[5]：一個(gè)酶活單位是指1 min 內(nèi)木瓜蛋白酶分解酪蛋白產(chǎn)生1 μmol 酪氨酸，詳細(xì)操作步驟如下：

用移液管向1 mg/mL 酶溶液5 mL 中加入激活劑（2 mmol/L L-半胱氨酸和1 mmol/L 乙二胺四乙酸在pH 值7.0 磷酸緩沖液中的混合液5 mL）。置于最適溫度下在水浴鍋中水浴5 min，再用移液管向混合液中摻入質(zhì)量濃度為5 g/L 的底物酪蛋白溶液5 mL，反應(yīng)5 min 后向以前的混合溶液中加入5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸溶液[6]抑制木瓜蛋白酶的活性終止木瓜蛋白酶的催化反應(yīng)，之后用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)275 nm 處測(cè)定溶液中酪氨酸的質(zhì)量濃度[7]（根據(jù)在波長(zhǎng)275 nm 處測(cè)得的酪氨酸質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=170.32X-0.214 5，R2=0.997 計(jì)算得酪氨酸的濃度）。

1.5 測(cè)定游離的和固定化木瓜蛋白酶的最適溫度

Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶和游離的木瓜蛋白酶在55，60，65，70，75，80 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，于波長(zhǎng)275 nm 處采用紫外分光光度法分別測(cè)定Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶和游離的木瓜蛋白酶的最適溫度（酶活最高者為100%）[8]。

1.6 測(cè)定游離的和固定化木瓜蛋白酶在最適溫度下的熱穩(wěn)定性

取一定量的Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶和游離的木瓜蛋白酶各6 份，在pH 值7 的磷酸緩沖溶液中分別放置游離的木瓜蛋白酶和Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶，并于其相對(duì)應(yīng)的最適溫度下保溫1，2，3，4，5，6 h，測(cè)試各時(shí)間段木瓜蛋白酶的酶活性，以0 h 的木瓜蛋白酶的酶活性為100%，計(jì)算各時(shí)間段木瓜蛋白酶的相對(duì)酶活力[9]。

1.7 測(cè)定固定酶的酶活保留率

將Fe3O4磁性納米顆粒干燥后形成的磁粉與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的海藻酸鈉按質(zhì)量比3∶5 混合成均勻的膠體4 mL，并向均勻的膠體中加入一定質(zhì)量的木瓜蛋白酶，混合均勻后用6 號(hào)注射器將上述混合的膠體逐滴滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2溶液中靜置30 min，再用1.5%的C5H8O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 交聯(lián)1 h，收集Fe3O4磁性顆粒協(xié)同海藻酸鈉包埋產(chǎn)生的包埋粒，用去離子水反復(fù)清洗數(shù)次，以完全去除未固定的木瓜蛋白酶和多余的C5H8O2，并測(cè)定各種固定方法下固定的和游離的木瓜蛋白酶的總酶活力，計(jì)算木瓜蛋白酶的酶活保留率[10]。（制備海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶時(shí)，除去不加Fe3O4，其他步驟同上。其中，酶活保留率=固定酶總酶活力/游離酶總酶活力）

2 結(jié)果與分析

Fe3O4磁性納米顆粒粒徑較小、比表面積比較大，賦予了木瓜蛋白酶較大的比表面積，可為木瓜蛋白酶的固定化提供更多的吸附位點(diǎn)。Fe3O4磁性納米顆粒具有磁性吸附力，可利用通過(guò)施加場(chǎng)外磁力進(jìn)行攪拌及回收再利用。而Fe3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉固定的木瓜蛋白酶能通過(guò)外加磁場(chǎng)進(jìn)行磁力攪拌、分離回收，相較于海藻酸鈉固定的木瓜蛋白酶而言, Fe3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉固定的木瓜蛋白酶能夠在完成催化后更好地回收再利用。

2.1 木瓜蛋白酶的最適溫度

溫度對(duì)酶活性的影響見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)酶活性的影響

由圖1 可知，游離的木瓜蛋白酶的最適溫度是65 ℃，而Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的最適溫度是75 ℃，游離的木瓜蛋白酶的最適溫度比Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的最適溫度下降了10 ℃。當(dāng)反應(yīng)溫度高于木瓜蛋白酶的最適溫度時(shí)，隨著溫度的不斷攀升，游離的木瓜蛋白酶的酶活性快速下降，而Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的酶活性下降速度相對(duì)于游離的木瓜蛋白酶的酶活性下降速度要慢一些，說(shuō)明Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的酶活性受溫度影響較小，可能是Fe3O4磁性納米顆粒的屏蔽作用對(duì)木瓜蛋白酶起到一定的保護(hù)作用。

2.2 木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性

酶的熱穩(wěn)定性見(jiàn)圖2。

圖2 酶的熱穩(wěn)定性

由圖2 可知，在最適溫度下，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶在最適溫度下6 h 后，酶的相對(duì)酶活力仍保持原先的62.5%，而游離的木瓜蛋白酶的相對(duì)酶活力只有原先的24.7%，由試驗(yàn)結(jié)果可得出，游離的木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性顯著低于Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果很可能是Fe3O4磁性納米顆粒吸附木瓜蛋白酶阻止了木瓜蛋白酶的聚集和改變了木瓜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)造成的。

2.3 固定化酶的酶活保留率

各種形式木瓜蛋白酶的酶活保留率見(jiàn)表1。

表1 各種形式木瓜蛋白酶的酶活保留率

由表1 可知，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率為42.86%，海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶的酶活保留率為52.61%，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶的酶活保留率為69.44%，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶的酶活保留率比Fe3O4磁性納米顆粒固定木瓜蛋白酶和海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶的酶活保留率都要高，可能是Fe3O4磁性納米顆粒的靜電吸附作用產(chǎn)生的影響, Fe3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉包埋木瓜蛋白酶時(shí)，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒周?chē)驗(yàn)殪o電作用聚集了更多的酶，所以在海藻酸鈉包埋時(shí)可固定更多的木瓜蛋白酶，提升木瓜蛋白酶的酶活保留率。

固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率比游離的木瓜蛋白酶的酶活保留率下降了，造成的結(jié)果可能是在固定過(guò)程中游離的木瓜蛋白酶并沒(méi)有全部固定于載體上，有一部分隨著洗滌流失了，還有可能是木瓜蛋白酶固定在載體上形成了空間阻礙并改變了木瓜蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，以及戊二醛在交聯(lián)的過(guò)程中抑制了木瓜蛋白酶的部分活力造成的。

3 結(jié)論

以Fe3O4磁性納米顆粒作為木瓜蛋白酶的固定化載體，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒固定木瓜蛋白酶的酶活保留率為42.86%，海藻酸鈉固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率為52.61%，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉固定的木瓜蛋白酶的酶活保留率為69.44%。游離的木瓜蛋白酶的最適溫度是65 ℃，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的最適溫度是75 ℃，游離的木瓜蛋白酶的最適溫度比Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶的最適溫度下降了10 ℃，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶在最適溫度下的熱穩(wěn)定性也明顯改善。Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶在使用過(guò)程中可以通過(guò)操作外部磁場(chǎng)來(lái)控制Fe3O4磁性納米顆粒固定的木瓜蛋白酶在反應(yīng)體系中的運(yùn)動(dòng)軌跡、速度、方式及方法，取代了傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌，降低了因機(jī)械攪拌而損傷的酶活性，提高了Fe3O4磁性納米顆粒固定化酶的酶活性，進(jìn)一步提高了Fe3O4磁性納米顆粒固定化酶的活性保留率及催化效率，經(jīng)Fe3O4磁性納米顆粒固定化后的蛋白酶更容易被提煉分離出來(lái)。從Fe3O4磁性納米顆粒協(xié)同海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶的酶活保留率比Fe3O4磁性納米顆粒和海藻酸鈉單獨(dú)固定木瓜蛋白酶的酶活保留率要高，可以看出Fe3O4磁性納米顆粒協(xié)同包埋材料相互協(xié)作能更好地起到固定酶的作用。另外，F(xiàn)e3O4磁性納米顆粒還可作為標(biāo)記物用于研究酶在人體內(nèi)的作用位點(diǎn)，因而Fe3O4磁性納米顆粒表現(xiàn)出了強(qiáng)大的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，是酶固定化的優(yōu)良載體。