毛麟宇，鹿士振，王偉群，張春斌，張麗娜

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯154003;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯154007;3.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯154007;4.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)系、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 漳州 363000;5.大慶油田總醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 大慶 163000)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，具體發(fā)病分子機(jī)制尚有待研究。相關(guān)研究稱感染性疾病和慢性炎癥約占致癌因素的25%。慢性炎癥時(shí)炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞均可產(chǎn)生反應(yīng)性氧(reactive oxygen species,ROS)或反應(yīng)性氮(reactive nitrogen species,RNS)，引起DNA的損傷、突變，進(jìn)而可能引發(fā)惡性腫瘤的發(fā)生。而乙肝、丙肝導(dǎo)致的慢性肝炎的長(zhǎng)期不愈，反復(fù)發(fā)作，將導(dǎo)致肝臟的病變：肝纖維化及肝硬化，并最終發(fā)展為肝癌。趨化因子3(C-X-C motif chemokine ligand 3，CXCL3)作為炎性細(xì)胞因子的一種，在肝細(xì)胞癌中保持較高的表達(dá)水平，正符合惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的炎性微環(huán)境理論。

長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)下，氧化應(yīng)激失衡，ROS對(duì)核酸、蛋白、脂質(zhì)等的氧化作用促進(jìn)了惡性腫瘤的發(fā)生，損傷的DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，又會(huì)誘導(dǎo)干擾素介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)ROS的產(chǎn)生，保持著腫瘤的炎癥環(huán)境。適量的ROS在惡性腫瘤的進(jìn)程中激活了對(duì)細(xì)胞有利的信號(hào)，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，存活和抗氧化應(yīng)激能力。而過(guò)高的ROS會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的持續(xù)突變和基因組不穩(wěn)定性。癌癥的發(fā)展中也需要依賴于內(nèi)源性抗氧化劑來(lái)減輕氧化應(yīng)激，使其保持在一定的水平。

有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)CXCL3在肝細(xì)胞癌中表達(dá)高于癌旁組織且跟腫瘤的炎癥環(huán)境相關(guān)[1-2]，但關(guān)于肝癌中CXCL3和氧化應(yīng)激之間的關(guān)系尚未有人研究。本課題的目的在于研究CXCL3表達(dá)水平發(fā)生改變后，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平變化情況，驗(yàn)證在肝癌細(xì)胞中CXCL3與氧化應(yīng)激水平的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料肝癌細(xì)胞系來(lái)源于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)；CXCL3病毒轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；BeyoRTTMⅡ cDNA第一鏈合成試劑盒、RIPA裂解液(強(qiáng))購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；熒光定量試劑購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司公司；血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)抗體、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)試盒(羥胺法)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(硫代巴比妥酸法)購(gòu)自萬(wàn)類生物有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞按5×104個(gè)/mL的濃度鋪入24孔板中；將載有CXCL3高表達(dá)和CXCL3敲除及各自對(duì)照的帶有嘌呤霉素抗性及相應(yīng)熒光蛋白質(zhì)粒的慢病毒顆粒與完全培養(yǎng)基按11混合；按轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細(xì)胞中(依次命名為：vector-CXCL3和sh-CXCL3)；培養(yǎng)12～16 h后，加入嘌呤霉素(終濃度為2 μg/mL)進(jìn)行篩選；純度達(dá)到90%以上后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖細(xì)胞按1.5×103個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中；細(xì)胞在37 ℃培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，分別向設(shè)定孔中加入10 μL CCK-8試劑；37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h后用酶標(biāo)儀讀取各孔450 nm處的吸光度值。

1.4 Western Blotting法將30 μg的細(xì)胞總蛋白經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳處理后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜；質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂乳封閉后，用兔抗HO-1多克隆抗體(11 000稀釋)在4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌3次×5 min；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗(15 000稀釋)在37 ℃孵育1 h；TBST洗滌4次×10 min；ECL試劑孵育膜，使信號(hào)可視化；用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像系統(tǒng)進(jìn)行曝光、拍照，并對(duì)圖像進(jìn)行量化和分析。

1.5 氧化應(yīng)激處理將等量細(xì)胞鋪到6孔板的4個(gè)孔，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)按最終為0、100、200、400 μmol/L的濃度梯度將過(guò)氧化氫加入6孔板，正常培養(yǎng)24 h，提取4個(gè)孔的總RNA，反轉(zhuǎn)錄，熒光定量檢測(cè)各自的CXCL3的表達(dá)量。

1.6 SOD、MDA測(cè)定SOD、MDA的測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 CXCL3的表達(dá)情況本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CXCL3在肝癌組織的轉(zhuǎn)錄水平與正常組織比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.864，P=0.075)。CXCL3高表達(dá)患者與CXCL3低表達(dá)患者相比，總生存率低(P=0.001)。見(jiàn)圖1、2。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中CXCL3在不同肝臟組織中表達(dá)的比較

2.2 CXCL3與氧化應(yīng)激的關(guān)聯(lián)分析

2.2.1 過(guò)氧化氫處理后CXCL3的表達(dá) 過(guò)氧化氫濃度為100 μmol/L時(shí)，CXCL3的表達(dá)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.716,P=0.494)。當(dāng)濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，CXCL3的表達(dá)下降(t=3.275,P=0.004)。當(dāng)濃度達(dá)到400 μmol/L時(shí)，CXCL3的表達(dá)水平下降更加明顯(t=5.162,P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖2 CXCL3表達(dá)對(duì)肝癌患者生存率的影響

圖3 過(guò)氧化氫處理后肝癌細(xì)胞中CXCL3表達(dá)情況分析

2.2.2 CXCL3與氧化應(yīng)激基因的關(guān)聯(lián)分析 生物信息學(xué)分析結(jié)果所示，肝癌組織中有7個(gè)與CXCL3表達(dá)相關(guān)的氧化應(yīng)激基因。包括1個(gè)負(fù)相關(guān)基因PTGS2(COX2)；6個(gè)正相關(guān)基因，分別為CYBB、SOD3、NCF1、NCF2、UCP2和HMOX1。見(jiàn)圖4。

圖4 與CXCL3表達(dá)相關(guān)的氧化應(yīng)激基因及其相關(guān)系數(shù)

2.3 熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果為了驗(yàn)證CXCL3表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，本研究設(shè)計(jì)了高表達(dá)CXCL3細(xì)胞和低表達(dá)CXCL3細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CXCL3的SMMC-7721細(xì)胞中CXCL3的表達(dá)接近其對(duì)照的2倍(t=3.432，P=0.034)；RNAi干擾SMMC-7721細(xì)胞的CXCL3表達(dá)是對(duì)照組的20%左右(t=9.957，P=0.014)。見(jiàn)圖5。

圖5 轉(zhuǎn)染后SMMC-7721細(xì)胞中CXCL3表達(dá)情況

2.4 CCK-8增殖情況SMMC-7721細(xì)胞中，穩(wěn)定高表達(dá)CXCL3的細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于對(duì)照(t=4.180,P<0.001)；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組(t=60.201,P<0.001)。見(jiàn)圖6。

圖6 CXCL3表達(dá)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

2.5 SOD測(cè)定結(jié)果SMMC-7721細(xì)胞中，高表達(dá)CXCL3的細(xì)胞SOD水平高于對(duì)照組(t=253.301,P<0.001)；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞SOD水平低于對(duì)照組(t=253.782,P<0.001)。見(jiàn)圖7。

圖7 CXCL3表達(dá)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中SOD水平的影響

2.6 MDA測(cè)定結(jié)果SMMC-7721細(xì)胞中，高表達(dá)CXCL3的細(xì)胞MDA含量高于對(duì)照組(t=19.485,P<0.001)；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞MDA含量低于對(duì)照組(t=11.265,P<0.001)。見(jiàn)圖8。

圖8 CXCL3表達(dá)對(duì)SMMC-7721細(xì)胞MDA水平的影響

2.7 HO-1表達(dá)情況SMMC-7721細(xì)胞中，高表達(dá)CXCL3的細(xì)胞HO-1相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組(t=5.592,P<0.001)；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞HO-1相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照(t=13.064,P<0.001)。見(jiàn)圖9、10。

圖9 高表達(dá)CXCL3 SMMC-7721細(xì)胞中HO-1表達(dá)情況

圖10 低表達(dá)CXCL3 SMMC-7721細(xì)胞中HO-1表達(dá)情況

3 討論

3.1 CXCL3的表達(dá)水平影響肝癌的惡性表型CXCL3是一種生長(zhǎng)因子蛋白，與CXCR2結(jié)合，并作為中性粒細(xì)胞的趨化劑。作為一種重要的趨化因子，CXCL3在多種腫瘤中有一定的表達(dá)。在宮頸癌中，腫瘤組織高表達(dá)CXCL3[3-4]；CXCL3通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移、抑制其凋亡[5]。

在研究頭頸部癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，CXCL3在口腔鱗癌組織中的表達(dá)高于正常組織，與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；CXCL3的高表達(dá)促進(jìn)了裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶阻斷劑PD98059可減弱CXCL3誘導(dǎo)的增殖和遷移效應(yīng)[6]。CXCL3在頭頸部鱗癌中的表達(dá)高于正?；颊?，CXCL3高表達(dá)患者組總生存率較低，其表達(dá)水平會(huì)影響凋亡、Toll樣受體、Nod樣等多種信號(hào)通路基因[7]。

Han等[2]建立的裸鼠模型中，與相鄰正常組織相比，肝癌組織中CXCL3的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。同樣，Zhang等[8]報(bào)道CXCL3的高表達(dá)表明預(yù)后不良，通過(guò)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化增強(qiáng)了肝癌干細(xì)胞的維持和腫瘤發(fā)生。

本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)CXCL3在肝癌組織的轉(zhuǎn)錄水平高于正常組織。高表達(dá)CXCL3的患者比低表達(dá)CXCL3患者總生存率低。這與Wang等[9]的數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致，說(shuō)明CXCL3的表達(dá)水平也會(huì)影響肝癌的發(fā)病進(jìn)程。

3.2 CXCL3與氧化應(yīng)激基因的關(guān)聯(lián)分析有研究[10]表明，氧化應(yīng)激的失衡可以加速細(xì)胞惡性衍變過(guò)程，并且影響腫瘤預(yù)后的效果。但是，迄今為止，仍不清楚腫瘤細(xì)胞中氧化應(yīng)激分子調(diào)控及其作用機(jī)制的完整網(wǎng)絡(luò)，影響肝癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激失衡的關(guān)鍵分子也不清楚。

我們先利用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721，使其處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，來(lái)檢測(cè)CXCL3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，過(guò)氧化氫濃度達(dá)到200、400 μmol/L時(shí)，CXCL3的表達(dá)水平下降，并且隨著過(guò)氧化氫濃度增加，下降幅度逐漸增大。此結(jié)果可以說(shuō)明，CXCL3的表達(dá)與肝癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)密切相關(guān)。

為了探討肝癌細(xì)胞中的氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)情況，本研究利用cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)，分析了肝癌細(xì)胞中與CXCL3基因共表達(dá)的氧化應(yīng)激基因，利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david-d.ncifcrf.gov/，6.7版本)對(duì)其進(jìn)行了功能富集分析。結(jié)果顯示，當(dāng)P<0.001時(shí)，在與CXCL3基因相關(guān)的基因功能注釋中，獲得了7個(gè)與氧化應(yīng)激和腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，包括1個(gè)負(fù)相關(guān)基因：PTGS2(COX2)；6個(gè)正相關(guān)基因：CYBB、SOD3、NCF1、NCF2、UCP2和HMOX1。

值得關(guān)注的是，與CXCL3負(fù)相關(guān)基因COX2，在大多數(shù)正常組織都未能找到。最近，其已被證明可在多種惡性腫瘤患者體內(nèi)檢出，顯示在腫瘤病患中起重要作用[11-13]。這是一個(gè)誘導(dǎo)酶，功能是激活巨噬細(xì)胞或其他細(xì)胞，充斥于炎癥組織[14]。這與我們前期研究CXCL3影響炎癥、腫瘤的進(jìn)程結(jié)果吻合。

3.3 CXCL3表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響為了驗(yàn)證CXCL3表達(dá)水平對(duì)肝癌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，我們?cè)O(shè)計(jì)了高表達(dá)CXCL3細(xì)胞株和低表達(dá)CXCL3細(xì)胞。

3.3.1 CXCL3表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響 本研究中，高表達(dá)CXCL3的SMMC-7721細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于對(duì)照組；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組。由此可以說(shuō)明，CXCL3的表達(dá)水平與SMMC-7721細(xì)胞增殖密切相關(guān)，而氧化應(yīng)激水平的改變很可能就是由增殖能力的變化引起的。

3.3.2 CXCL3表達(dá)對(duì)SOD的影響 SOD是機(jī)體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，是一種能夠催化超氧化物通過(guò)歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為氧氣和過(guò)氧化氫的酶，而體內(nèi)的其他酶會(huì)立即將過(guò)氧化氫分解為完全無(wú)害的水。因此，SOD能專一清除體內(nèi)有害的自由基，以解除自由基氧化體內(nèi)的某些組成成分而造成的機(jī)體損害。

本研究中，高表達(dá)CXCL3的SMMC-7721細(xì)胞SOD高于對(duì)照組；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞SOD低于對(duì)照組。這也與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)中CXCL3與SOD基因呈正相關(guān)結(jié)果一致。

SOD在機(jī)體的氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用。高表達(dá)CXCL3能引起SOD增加，這說(shuō)明在一定范圍內(nèi)增加CXCL3可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。這與Wang等[15]發(fā)現(xiàn)人參皂苷抗氧化機(jī)制相類似。

3.3.3 CXCL3表達(dá)對(duì)MDA的影響 MDA是細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，其產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此，MDA的多少能夠代表膜脂過(guò)氧化的程度。

本研究結(jié)果顯示，在SMMC-7721細(xì)胞中，高表達(dá)CXCL3的細(xì)胞MDA高于對(duì)照組；低表達(dá)CXCL3的細(xì)胞MDA低于對(duì)照組。由此可以說(shuō)明，CXCL3的表達(dá)水平與SMMC-7721細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)。這與Li等[16]從枸杞中提取的枸杞多糖-4a對(duì)MDA的作用類似。

在很多研究中，SOD與MDA呈負(fù)相關(guān)，通常給以氧化應(yīng)激刺激后，SOD降低而MDA升高。例如，檢測(cè)急性心肌梗死患者外周血[17]和噪聲暴露情況下大鼠耳蝸皮質(zhì)組織[18]都屬于此類情況。但本研究中，高表達(dá)CXCL3的肝癌細(xì)胞中MDA升高可以說(shuō)明細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)處于更高水平，而相對(duì)于CXCL3正常表達(dá)水平時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)期處于增殖增加的狀態(tài)，這說(shuō)明MDA等過(guò)氧化狀態(tài)對(duì)細(xì)胞損傷影響得以消除，即細(xì)胞的抗氧化能力的到了提高，SOD水平的升高正對(duì)應(yīng)這一結(jié)論，反之亦然。

3.3.4 CXCL3表達(dá)對(duì)HO-1的影響 HO在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和體內(nèi)平衡中起著關(guān)鍵作用。其表達(dá)或活性的失調(diào)與多種人類疾病的病理生理學(xué)有關(guān)，包括心血管疾病、糖尿病、肥胖、肺病、胃腸疾病、腎功能障礙、皮炎、癌癥等。因此，血紅素加氧酶被認(rèn)為是許多人類疾病的預(yù)防、治療干預(yù)中最重要的目標(biāo)之一[19]。

本研究結(jié)果顯示，在SMMC-7721細(xì)胞中，高表達(dá)CXCL3細(xì)胞的HO-1表達(dá)高于對(duì)照組；低表達(dá)CXCL3細(xì)胞HO-1表達(dá)低于對(duì)照組。由此可以說(shuō)明，CXCL3的表達(dá)水平與HO-1表達(dá)密切相關(guān)，這與增加HO-1表達(dá)可能導(dǎo)致一些疾病的進(jìn)展，如神經(jīng)退行性變、致癌的觀點(diǎn)吻合[20]。

當(dāng)前的惡性腫瘤相關(guān)研究已不再局限于進(jìn)行某一因子的調(diào)控機(jī)制，而是強(qiáng)調(diào)整個(gè)的腫瘤微環(huán)境的作用。本課題根據(jù)惡性腫瘤的炎癥環(huán)境對(duì)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響，首次提出了在肝癌細(xì)胞中，CXCL3表達(dá)與細(xì)胞氧化應(yīng)激水平具有相關(guān)性的觀點(diǎn)。但由于本課題只涉及了CXCL3與肝癌的相關(guān)性，沒(méi)有進(jìn)行具體的調(diào)控關(guān)系及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究，且炎癥細(xì)胞因子僅選用了CXCL3，不能系統(tǒng)地詮釋炎癥相關(guān)因子與氧化應(yīng)激的關(guān)系。這些問(wèn)題將在課題組今后的研究中逐漸解決。