李炳，張 勇 ，賈 琦*，李醫(yī)明，朱維良

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，上海 201203

2.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建新疆特有藥用資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新疆 烏魯木齊 830011

3.中國科學(xué)院上海藥物研究所，新藥研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中科院受體結(jié)構(gòu)與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203

4.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

毛裂蜂斗菜Petasites tricholobusFranch.是菊科（Compositae）千里光族（Senecioneae Cass.）蜂斗菜屬PetasitesMill.的多年生草本植物[1]。蜂斗菜屬植物全球共有18種，分布于歐洲、亞洲、北美洲，我國有6個(gè)品種，分別是蜂斗菜P.japonicus(Seib.et Zucc.) Maxim、掌葉蜂斗菜P.tatewakianusKitam.、鹽源蜂斗菜P.versipilisHand.Mazz、臺(tái)灣蜂斗菜P.formasanusKitam.、長白蜂斗菜P.rubellus(J.F.Gmel.) Toman和毛裂蜂斗菜P.tricholobusFanch.，其廣泛分布于東北、華東和西南部[2]。毛裂蜂斗菜具有清熱解毒、散瘀消腫功效，民間常用于治療扁桃體炎、毒蛇咬傷、解毒去痰等病癥[3]?，F(xiàn)代研究表明，毛裂蜂斗菜具有豐富的藥理活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗過敏、抗腦缺血、抗炎等[4-8]。本課題組前期對(duì)毛裂蜂斗菜95%乙醇提取物中化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，從中分離得到多個(gè)酚類化合物[9]和2個(gè)特征性的倍半萜硫酸酯類化合物[10]。近期，本課題組從該植物50%乙醇提取物中分離得到5個(gè)倍半萜類化學(xué)成分（圖1），其中化合物1為新化合物，命名為毛裂蜂斗菜素（petatricholide），其余4個(gè)化合物均為倍半萜螺內(nèi)酯類化合物，分別為bakkenolide IIIb（2）、monoketone（3）、japonipene C（4）和petatewalide A（5），化合物2～5均為首次從毛裂蜂斗菜中分離得到。

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound 1

1 儀器與材料

ESI-MS由Agilent G6520 Q-TOF LC-MS型質(zhì)譜儀測(cè)定；EI-MS由Thermo DFS型質(zhì)譜儀測(cè)定；旋光用Autopol VI 90079型旋光儀測(cè)定；紅外光譜用Thermo nicolet 6700型紅外光譜儀測(cè)定；1H、13C和2D NMR用Bruker Avance III 500型核磁共振儀測(cè)定，ROESY用Varian vnmrs 400型核磁共振儀測(cè)定，以TMS為內(nèi)標(biāo)。300～400目硅膠、H硅膠（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；ODS-A-HG 12 nm S-50 μm（日本YMC公司）；Sephadex LH-20型凝膠（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）；微孔樹脂（MCI GEL CHP20P，日本三菱化學(xué)株式會(huì)社）；硅膠GF254預(yù)制薄層色譜板（煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所），顯色劑（硫酸-香蘭素顯色劑）；所用試劑甲醇、乙醇、醋酸乙酯、正丁醇、石油醚、環(huán)己烷、二氯甲烷等試劑均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

本實(shí)驗(yàn)藥材毛裂蜂斗菜全草于2009年10月采自重慶，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳立宏研究員鑒定為菊科蜂斗菜屬植物毛裂蜂斗菜P.tricholobusFanch.，標(biāo)本（FDC-20091029）保存于上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室。

2 提取與分離

干燥的毛裂蜂斗菜全草（6.5 kg），粉碎后采用95% 乙醇加熱回流提取3次，藥渣采用50%乙醇100 ℃回流提取2次，收集2次濾液濃縮得到50%乙醇提取濃縮液。50%乙醇提取液依次采用醋酸乙酯和正丁醇等體積多次萃取，依次得到醋酸乙酯和正丁醇萃取液，減壓濃縮后分別獲得醋酸乙酯萃取物（21 g）、正丁醇萃取物（153 g）和萃取后水層3個(gè)部位。隨后采用薄層色譜（TLC）方法對(duì)醋酸乙酯和正丁醇萃取物中主要特征性成分進(jìn)行初步分析，根據(jù)倍半萜類化合物在顯色劑（硫酸-香蘭素顯色劑）下的顯色特征，優(yōu)選醋酸乙酯萃取物進(jìn)行后續(xù)的分離純化。

醋酸乙酯萃取部位（21 g）采用300～400目硅膠，以二氯甲烷-甲醇體系梯度洗脫（15∶1、9∶1、6∶1、4∶1、1∶1），得到4個(gè)組分（Fr.1～4）。Fr.1（5.3 g）經(jīng)H硅膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯體系進(jìn)行梯度洗脫（40∶1、20∶1、9∶1、6∶1、4∶1、2∶1），得到4個(gè)組分（Fr.1.1～1.4）。Fr.1.1（1.6 g）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜進(jìn)行純化，二氯甲烷-甲醇等度洗脫（1∶1），得到Fr.1.1.1（960 mg）。Fr.1.1.1經(jīng)ODS柱色譜，甲醇-水（0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、75∶25）梯度洗脫，得到化合物1（2.5 mg）、4（24.9 mg）、5（7.1 mg）。Fr.1.3（812 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜二氯甲烷-甲醇等度洗脫（1∶1），洗脫后主成分采用ODS柱色譜二次純化，甲醇-水梯度洗脫（0∶100、20∶80、40∶60、60∶40、80∶20）后得到化合物2（16.7 mg）。Fr.2（2.1 g）經(jīng)300～400目硅膠柱色譜，以石油醚-醋酸乙酯（30∶1、15∶1、10∶1、6∶1、4∶1、1∶1）梯度洗脫，得到3個(gè)組分（Fr.2.1～2.3）。Fr.2.2（163 mg）經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，二氯甲烷-甲醇等度洗脫（1∶1），洗脫后主成分采用MCI柱色譜，甲醇-水梯度洗脫（0∶100、20∶80、40∶60、50∶50、70∶30）分離純化，得到化合物3（2.9 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)化合物1的HR-ESI-MSm/z471.181 1 [M+Na]+（計(jì)算值471.181 7，C24H32O6SNa），確定該化合物的分子式為C24H32O6S，相對(duì)分子質(zhì)量為448，不飽和度為9。IR光譜中1732 cm?1和 1647 cm?1處的特征吸收峰表明其結(jié)構(gòu)中含有α,β-不飽和酯。1H-NMR數(shù)據(jù)顯示（表1），高場(chǎng)區(qū)有6個(gè)甲基信號(hào)δH2.41 (3H, s), 1.98 (3H, m), 1.89 (3H, t,J= 1.5 Hz),1.71 (3H, brs), 1.66 (3H, brs) 和1.42 (3H, s)；δH7.35(1H, d,J= 10.2 Hz), 5.76 (1H, d,J= 10.2 Hz) 信號(hào)提示結(jié)構(gòu)中含有1組順式不飽和烯氫質(zhì)子。13C-NMR數(shù)據(jù)（表1）顯示該化合物含有24個(gè)碳信號(hào)，結(jié)合DEPT135圖譜信息顯示δC24.6, 19.4, 17.6,16.7, 14.7, 13.7為6個(gè)甲基信號(hào)，δC112.6, 31.9和31.3為3個(gè)亞甲基信號(hào)，δC154.4, 138.3, 119.1, 110.7,75.2, 74.5, 64.3, 44.0為8個(gè)次甲基信號(hào)，δC201.7,166.9, 165.3, 147.9, 134.1, 127.8, 61.3為7個(gè)季碳信號(hào)。δC201.7信號(hào)提示結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)酮式結(jié)構(gòu)，δC166.9和165.3顯示結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)酯鍵，δC154.4,147.9, 138.3, 134.1, 127.8, 119.1, 112.6, 110.7則顯示結(jié)構(gòu)中含有8個(gè)不飽和碳信號(hào)。上述特征信號(hào)與化合 物 1α-(3′-ethyl-cis-crotonoyloxy)-8-angeloyloxy-3β,4β-epoxy-bisabola-7(14),10-diene[11]類似，主要差異在于化合物1的C-1位取代基是甲基硫代丙烯酰氧基（methylthioacryloyloxy），而已報(bào)到化合物C-1位是乙?；〈；衔?的平面結(jié)構(gòu)通過HSQC與HMBC譜做進(jìn)一步的確定，在HMBC譜（圖2）中H-1 (δH5.72, 1H) 和C-1′ (δC165.3) 相關(guān)，顯示甲基硫代丙烯酰氧基與C-1相連；H-8 (δH5.21, 1H)和 C-1′′(δC166.9) 相關(guān)，顯示當(dāng)歸酰氧基(angeloyloxy) 與C-8相連；H-14 (δH5.27, 1H;δH5.16, 1H) 和C-7 (δC147.9), C-8 (δC75.2), C-6 (δC44.0) 相關(guān)，H-8 (δH5.21, 1H) 和C-7 (δC147.9) 相關(guān)，H-6 (δH2.94, 1H) 和C-7 (δC147.9), C-14 (δC112.6) 相關(guān)，上述信號(hào)顯示C-7位是連接C-14、C-8和C-6位的關(guān)鍵位點(diǎn)；H-12 (δH1.71, 3H) 和C-11 (δC134.1), C-10 (δC119.1) 相關(guān)，H-13 (δH1.66, 3H) 和C-11 (δC134.1) 相關(guān)，上述信號(hào)顯示12和13位甲基與C-11相連；H-15 (δH1.42, 3H) 和C-3 (δC61.3),C-4 (δC64.3), C-2 (δC201.7) 相關(guān)，顯示15位甲基與C-3相連；H-4′ (δH2.41, 3H) 和C-3′ (δC154.4) 相關(guān)，顯示4′位甲基與C-3′相連；H-4′′ (δH1.98, 3H) 和C-3′′ (δC138.3), C-2′′ (δC127.8) 相關(guān)，H-5′′ (δH1.89,3H) 和C-1′′ (δC166.9), C-2′′ (δC127.8), C-3′′ (δC138.3) 相關(guān)，上述信號(hào)顯示4′′和5′′甲基分別與C-3′′和C-2′′相連。1H-1H COSY譜（圖2）進(jìn)一步證實(shí)，H-1 (δH5.72, 1H) 和H-6 (δH2.94, 1H) 相連，H-6 (δH2.94, 1H) 和H-5 (δH2.61, 1H;δH2.16, 1H) 相連，H-5 (δH2.61, 1H;δH2.16, 1H) 和H-4 (δH3.55, 1H)相連；H-8 (δH5.21, 1H) 和H-9 (δH2.42, 2H) 相連，H-9 (δH2.42, 2H) 和H-10 (δH5.11, 1H) 相連；H-2′(δH5.76, 1H) 和H-3′ (δH7.35, 1H) 相連；H-3′′ (δH6.16, 1H) 和 H-4′′ (δH1.98, 3H) 相連。結(jié)合1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC及1H-1H COSY譜，化合物1的平面結(jié)構(gòu)確定為1-(cis-methylthioacryloyloxy)-8-angeloyloxy-3,4-epoxy-bisabola-7(14),10-diene。

表1 化合物1的1H和13C-NMR數(shù)據(jù) (500/125 MHz, CD3OD)Table 1 1H and 13C-NMR data of compound 1 (500/125 MHz, CD3OD)

圖2 化合物1的HMBC (H→C) 和1H-1H COSY (?) 關(guān)鍵相關(guān)信號(hào)Fig.2 Key HMBC (H→C) and 1H-1H COSY (?)correlations of compound 1

ROESY譜（圖3）顯示，H-4與H-15相關(guān)，H-1與H-8相關(guān)，H-4與H-1、H-8均沒有相關(guān)信號(hào)。參考文獻(xiàn)已報(bào)到的相似倍半萜骨架[12]，將H-6定義為α-H，根據(jù)J1,6值 (12.8 Hz) H-1則為β-H，H-8同樣為β-H；由于H-4與H-1無相關(guān)，且參考J4,5偶合常數(shù)值 (4.3 Hz)，H-4則為α-H，H-15同樣為α-H。綜上，化合物1的相對(duì)構(gòu)型確定為1α-(cismethylthioacryloyloxy)-8α-angeloyloxy-3β,4β-epoxybisabola-7(14),10-diene，經(jīng)文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫檢索確定為新化合物，命名為毛裂蜂斗菜素。

圖3 化合物1的ROESY關(guān)鍵相關(guān)信號(hào)Fig.3 Key ROESY correlations of compound 1

化合物2：白色無定形粉末（甲醇）；EI-MSm/z:466 [M-H]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 7.09(1H, d,J= 10.2 Hz, H-3′′), 6.93 (1H, d,J= 10.0 Hz,H-3′), 5.83 (1H, d,J= 11.4 Hz, H-9), 5.81 (1H, d,J=10.2 Hz, H-2′′), 5.53 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-2′), 5.19(1H, s, H-13a), 5.14 (1H, s, H-13b), 5.14 (1H, dt,J=11.5, 5.3 Hz, H-1), 4.65 (2H, brs, H-12), 2.74 (1H, dd,J= 11.4, 5.1 Hz, H-10), 2.39 (3H, s, H-4′′), 2.35 (3H,s, H-4′), 2.23 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6a), 1.94 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6b), 1.83 (1H, m, H-2a), 1.79 (1H, m,H-2b), 1.66 (1H, m, H-3a), 1.57 (1H, m, H-4), 1.34(1H, dddd,J= 16.5, 13.3, 13.3, 4.3 Hz, H-3b), 1.10(3H, s, H-15), 0.89 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 177.9 (C-8), 165.7(C-1′), 165.2 (C-1′′), 153.3 (C-3′′), 151.9 (C-3′), 147.9(C-11), 113.0 (C-2′), 112.4 (C-2′′), 108.0 (C-13), 80.6(C-9), 70.7 (C-12), 70.1 (C-1), 55.0 (C-7), 51.9(C-10), 45.7 (C-6), 43.2 (C-5), 35.4 (C-4), 29.5 (C-3),26.8 (C-2), 19.6 (C-15), 19.2 (C-4′, 4′′), 15.6 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物2為bakkenolide IIIb。

化合物3：白色無定形粉末（甲醇）；ESI-MSm/z:287.1 [M+Na]+, 550.9 [2M+Na]+；1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 5.30 (2H, dt,J= 16.3, 2.3 Hz,H-13), 4.86 (2H, dt,J= 13.9, 2.3 Hz, H-12), 4.58 (1H,d,J= 11.2 Hz, H-9), 2.91 (1H, dd,J= 11.2, 1.3 Hz,H-10), 2.70 (1H, m, H-3a), 2.27 (1H, m, H-3b), 2.09(1H, m, H-4), 2.06 (2H, brs, H-6), 1.96 (1H, m, H-2a),1.68 (1H, dddd,J= 17.9, 13.7, 4.5, 4.4 Hz, H-2b),1.08 (3H, s, H-15), 1.02 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 212.8 (C-1), 179.9(C-8), 148.7 (C-11), 106.0 (C-13), 85.1 (C-9), 70.7(C-12), 67.1 (C-10), 57.9 (C-7), 45.9 (C-6), 45.4(C-5), 38.1 (C-3), 36.9 (C-4), 31.0 (C-2), 19.4 (C-15),14.3 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物3為monoketone。

化合物4：白色無定形粉末（甲醇）；ESI-MSm/z:473.2 [M+Na]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 7.04(1H, d,J= 10.0 Hz, H-3′), 5.77 (1H, d,J= 11.1 Hz,H-9), 5.62 (1H, d,J= 10.0 Hz, H-2′), 5.21 (1H, s,H-13a), 5.17 (1H, s, H-13b), 5.15 (1H, dt,J= 12.2,4.9 Hz, H-1), 4.68 (2H, s, H-12), 2.75 (1H, dd,J=11.1, 4.8 Hz, H-10), 2.39 (3H, s, H-4′), 2.25 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6a), 2.14 (2H, m, H-2′′), 2.06 (1H, m,H-3′′), 1.95 (1H, d,J= 14.3 Hz, H-6b), 1.80 (1H, m,H-2a), 1.72 (1H, m, H-2b), 1.66 (1H, m, H-3a), 1.58(1H, m, H-4), 1.38 (1H, m, H-3b), 1.11 (3H, s, H-15),0.95 (6H, d,J= 6.5 Hz, H-4′′, 5′′), 0.90 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ: 177.5(C-8), 171.9 (C-1′′), 165.6 (C-1′), 152.5 (C-3′), 147.9(C-11), 112.5 (C-2′), 108.2 (C-13), 80.5 (C-9), 70.4(C-12), 70.3 (C-1), 54.7 (C-7), 51.9 (C-10), 46.2(C-6), 43.3 (C-2′′), 43.3 (C-5), 35.2 (C-4), 29.5 (C-3),26.7 (C-2), 25.1 (C-3′′), 22.5 (C-5′′), 22.4 (C-4′′), 19.5(C-15), 19.2 (C-4′), 15.5 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物4為japonipene C。

化合物5：白色無定形粉末（甲醇）；ESI-MSm/z:413.2 [M+Na]+；1H-NMR (500 MHz, CDCl3)δ: 5.76(1H, d,J= 11.2 Hz, H-9), 5.45 (1H, brs, H-2′), 5.20(1H, brs, H-13a), 5.17 (1H, brs, H-13b), 5.09 (1H, dt,J= 12.1, 4.9 Hz, H-1), 4.67 (2H, m, H-12), 2.74 (1H,dd,J= 11.2, 4.9 Hz, H-10), 2.24 (1H, d,J= 15.0 Hz,H-6a), 2.14 (3H, brs, H-5′), 2.02 (3H, s, H-2′′), 1.95(1H, d,J= 15.0 Hz, H-6b), 1.84 (3H, brs, H-4′), 1.79(2H, m, H-2), 1.67 (1H, m, H-3a), 1.57 (1H, m, H-4),1.36 (1H, m, H-3b), 1.11 (3H, s, H-15), 0.91 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-14)；13C-NMR (125 MHz, CDCl3)δ:177.7 (C-8), 170.0 (C-1′′), 165.5 (C-1′), 157.1 (C-3′),147.8 (C-11), 115.9 (C-2′), 108.3 (C-13), 80.9 (C-9),70.6 (C-12), 69.5 (C-1), 54.9 (C-7), 51.7 (C-10), 45.8(C-6), 43.3 (C-5), 35.4 (C-4), 29.6 (C-3), 27.4 (C-4′),26.8 (C-2), 21.2 (C-2′′), 20.1 (C-5′), 19.6 (C-15),15.6 (C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物5為petatewalide A。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)從毛裂蜂斗菜50%乙醇提取物中分離并鑒定了5個(gè)倍半萜類化合物，包括1個(gè)新化合物（1）以及4個(gè)首次從該植物中分離得到的螺內(nèi)酯類化合物（2～5）。本課題組通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，具有與化合物1相同骨架的特征型環(huán)氧倍半萜類結(jié)構(gòu)僅從菊科植物厚敦菊屬[17]、冬泉菊屬[18]、款冬屬[11,19]和橐吾屬[20]植物中分離得到，本研究證實(shí)菊科蜂斗菜屬植物同樣存在特征型的環(huán)氧倍半萜類化合物。由于菊科植物在外部形態(tài)方面存在嚴(yán)重的同塑性演化，且菊科千里光族亞族內(nèi)各屬系統(tǒng)位置及親緣關(guān)系的劃分依然是學(xué)術(shù)界爭(zhēng)論的焦點(diǎn)[21]，本研究在豐富蜂斗菜屬植物倍半萜類化合物類型的同時(shí)，可從植物次級(jí)代謝產(chǎn)物合成生源途徑方面為千里光族亞族群的劃分提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突