王蕊嬌，張育龍，董培良，韓 華*

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040

藥對是中藥配伍中的最小單元，因其組成簡單及具備中藥配伍的特點(diǎn)，成為現(xiàn)代復(fù)方研究的主要方向之一[1]。目前臨床上運(yùn)用的治療皮膚病的當(dāng)歸苦參丸，其藥方以當(dāng)歸、苦參為藥對，常用當(dāng)歸貝母苦參丸加減方治療消化系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)多種疾病[2-3]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸-苦參藥對也具有治療心肌缺血的作用[4]。研究表明[5-7]，心肌缺血發(fā)生時肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）均上調(diào)。當(dāng)歸始載《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫味甘、辛、苦，入心、肝、脾經(jīng)，為血病之要藥[8]，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之功效，主要化學(xué)成分為酚酸類（阿魏酸、綠原酸等）、內(nèi)酯類（藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯等）、香豆素和黃酮類、多糖類[9-10]?？鄥⑹驾d于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味苦、性寒，入心肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)[11]，具有清熱燥濕、殺蟲利尿、消炎、抗心律失常、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等的藥理活性[12-13]，主要化學(xué)成分為生物堿類（苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿和氧化槐果堿等）和黃酮類[14-15]。目前，在國內(nèi)外對當(dāng)歸-苦參不同配比的化學(xué)成分研究以及其治療心肌缺血的相關(guān)研究較少。

Box-Behnken設(shè)計（Box-Behnken design，BBD）是一種3因素3水平設(shè)計，通過多元2次方程擬合相關(guān)因素與響應(yīng)值的關(guān)系以尋求最佳工藝參數(shù)[16]。主成分分析（principal component analysis，PCA）法是將原有的多個變量降為成少數(shù)相互獨(dú)立且具有代表性的綜合指標(biāo)的方法[17]。目前，BBD法多用于優(yōu)化中藥單味藥、復(fù)方等提取工藝，PCA法多用于中藥材質(zhì)量分析及評價。本實(shí)驗首先采用BBD[18]對當(dāng)歸-苦參藥對的回流提取進(jìn)行工藝優(yōu)化，通過雙波長HPLC法[19]對當(dāng)歸-苦參藥對不同配伍中綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿、苦參酮11個成分進(jìn)行含量測定，再通過PCA法將生化指標(biāo)CK、CK-MB、IL-1β、IL-6、LDH等指標(biāo)與藥對化學(xué)成分含量整合，綜合各指標(biāo)評價不同配伍之間的差異，得出當(dāng)歸-苦參藥對的最佳配伍比例，為當(dāng)歸-苦參藥對的配伍特點(diǎn)和臨床應(yīng)用規(guī)律、解析以其為基礎(chǔ)的復(fù)方構(gòu)成及新的復(fù)方開發(fā)中提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；N-110型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；98-1-B型電熱套，天津市泰斯特儀器有限公司；AB204-N型分析天平，德國Mettler-Toledo公司；Epoch 2型酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 材料

當(dāng)歸飲片、苦參飲片，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開發(fā)教研室主任王振月教授鑒定，當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels的干燥根，苦參為豆科槐屬植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根。對照品綠原酸、阿魏酸、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，中國食品藥品檢定研究院，批號110753-200413、110773-201012、111737-201910、11826-201001；對照品洋川芎內(nèi)酯I，德思特生物技術(shù)有限公司，批號94596-28-8；對照品槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、氧化苦參堿、苦參酮，成都埃法生物科技有限公司，批號145572-44-7、110805-200508、26904-64-3、6882-68-4、16837-52-8、34981-26-5，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%。乙腈、甲醇為色譜純，購自北京邁瑞達(dá)科技有限公司；實(shí)驗用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。水合氯醛，購于黑龍江省久豐生物工程有限公司；CK、CKMB、IL-1β、IL-6、LDH試劑盒，購于天津阿爾法生物科技有限公司。

1.3 動物

SD大鼠購于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心，實(shí)驗動物合格證號SCXK2008-0001；所有大鼠單獨(dú)關(guān)在籠中，在溫度為（25±2）℃、相對濕度為30%～40%的受控標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗室環(huán)境下和12 h的明暗循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由進(jìn)水。所有大鼠均為常規(guī)飼養(yǎng)1周。所有動物實(shí)驗遵循黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會有關(guān)實(shí)驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 當(dāng)歸-苦參藥對含量測定方法建立

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，分別定容制成分別含綠原酸40.20 μg/mL、阿魏酸71.60 μg/mL、洋川芎內(nèi)酯I 32.60 μg/mL、藁本內(nèi)酯122.40 μg/mL、歐當(dāng)歸內(nèi)酯43.20 μg/mL的混合對照品溶液I和分別含槐果堿74.80 μg/mL、苦參堿92.60 μg/mL、氧化槐果堿268.00 μg/mL、槐定堿62.40 μg/mL、氧化苦參堿品324.00 μg/mL、苦參酮346.00 μg/mL的混合對照品溶液II，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取當(dāng)歸、苦參和當(dāng)歸-苦參1∶1，總量各為2 g，將藥材分別用10倍量70%乙醇回流提取1 h，濃縮，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，溶液用0.22 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為XBridge柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測當(dāng)歸指標(biāo)流動相為乙腈-0.03%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～20 min，5%～40%乙腈；20～40 min，40%～100%乙腈；檢測波長280 nm；檢測苦參指標(biāo)流動相為乙腈-0.03%氨水溶液，梯度洗脫：0～20 min，5%～40%乙腈；20～40 min，40%～100%乙腈；檢測波長220 nm[20-21]；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.1.4 專屬性實(shí)驗 精密吸取對照品溶液與供試品溶液，分別按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣10 μL測定。分別在當(dāng)歸中檢測綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，在苦參中檢測氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參酮、槐果堿和苦參堿。色譜圖見圖1、2。

圖1 當(dāng)歸-苦參 (1∶1) 樣品 (A)、當(dāng)歸樣品 (B)、混合對照品I (C)、苦參樣品 (D) 的HPLC圖 (280 nm)Fig.1 HPLC of ASR-SFR (1:1) sample (A), ASR sample(B), mixed reference substances Ⅰ (C), and SFR sample (D)(280 nm)

圖2 當(dāng)歸-苦參 (1∶1) 樣品 (A)、苦參樣品 (B)、混合對照品II (C)、當(dāng)歸樣品 (D) 的HPLC圖 (220 nm)Fig.2 HPLC of ASR-SFR (1:1) sample (A), SFR sample(B), mixed reference substances II (C), and ASR sample (D)(220 nm)

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述對照品儲備液120、100、80、60、40、20 μL至2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到不同質(zhì)量濃度水平的對照品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，測得峰面積積分值，以峰面積積分值（Y）與對照品質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。將混合對照品溶液逐級稀釋，以信噪比為10∶1確定定量限，以信噪比為3∶1確定檢測限。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Table 1 Linear relation investigation

2.1.6 精密度試驗 取混合對照品溶液I、II，按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣，連續(xù)測定6次，測得綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參酮、槐果堿和苦參堿峰面積的RSD分別為0.13%、0.22%、0.22%、1.10%、0.35%、0.13%、0.57%、0.20%、0.86%、0.17%、0.24%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取當(dāng)歸-苦參1∶1供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h按“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，測得綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參酮、槐果堿和苦參堿峰面積的RSD分別為1.6%、1.8%、1.2%、1.3%、1.2%、1.0%、1.4%、1.4%、0.65%、1.2%、1.7%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 稱取當(dāng)歸-苦參1∶1樣品適量，按“2.1.2”項下方法平行制備成供試品溶液，共6份，并在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定。綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參酮、槐果堿和苦參堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.2%、1.2%、1.3%、1.2%、1.2%、1.7%、1.6%、1.5%、1.6%、1.8%、1.9%，均小于2%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 取當(dāng)歸-苦參1∶1樣品 6份，每份0.2 g，分別精密加入對照品溶液適量，按“2.1.2”項下方法平行制備成供試品溶液，并在“2.1.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算各成分的平均回收率及其RSD值。通過加入等量相同的單一成分測得化學(xué)成分含量，綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參酮、槐果堿和苦參堿的平均回收率分別為98.41%、99.25%、99.25%、98.75%、98.59%、96.18%、98.01%、97.82%、97.52%、97.97%、97.38%，RSD值分別為為1.2%、1.4%、0.8%、0.96%、0.46%、0.76%、1.46%、0.81%、0.64%、1.2%、1.4%。測得值與理論值基本一致，都符合要求。

2.2 當(dāng)歸-苦參藥對的提取工藝優(yōu)化

2.2.1 BBD實(shí)驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗結(jié)果分析，運(yùn)用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取次數(shù)（B）、料液比（C）3種主要因素為變量，以當(dāng)歸-苦參藥對指標(biāo)成分總量提取率（Y）為響應(yīng)值設(shè)計響應(yīng)面分析，進(jìn)行回流提取工藝優(yōu)化試驗。由于提取次數(shù)為非連續(xù)變量，將提取次數(shù)按照總提取時間計算，從而轉(zhuǎn)化為連續(xù)變量，即提取1次為總提取時間1 h，提取2次為總提取時間2 h，提取3次為總提取時間3 h[22]，實(shí)驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface

2.2.2 響應(yīng)面模型建立與方差分析 通過Design Expert 12.0軟件綜合評分進(jìn)行線性回歸分析，得出擬合方程Y＝22.31+0.19 A-1.71 B-0.35 C-0.96 AB-4.37 AC-0.26 BC-10.45 A2-1.78 B2-4.63 C2。該模型的方差分析和結(jié)果（表3）顯示，R2＝0.965 4，說明模型擬合結(jié)果比較理想，F(xiàn)值為12.88，P＜0.000 1，說明模型具有顯著性差異。其中料液比和提取次數(shù)、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)因素交互影響顯著，而提取次數(shù)跟乙醇體積分?jǐn)?shù)交互影響不顯著。擬合的二次響應(yīng)面圖見圖3。根據(jù)預(yù)測模型得出最佳工藝為料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取次數(shù)為3次，每次1 h，總提取率23.24%。為驗證該模型的準(zhǔn)確性，在該條件下重復(fù)3次試驗，得出總提取率為24.75%，RSD為0.24%，與該模型預(yù)測值接近，說明該條件穩(wěn)定可行，具有重復(fù)性。

圖3 響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour map

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Table 3 Regression model and variance analysis of response surface

2.2.3 樣品含量測定 選取響應(yīng)面法中的最佳提取工藝來制備當(dāng)歸-苦參不同配伍（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1、0∶1），精密吸取上述供試品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件進(jìn)樣，平行測定3次，測得生藥中各指標(biāo)成分的含量。結(jié)果見表4。

表4 不同配伍比例中當(dāng)歸、苦參指標(biāo)性成分的HPLC含量測定 (n = 3)Table 4 Determination of index components of ASR and SFR in different ratios by HPLC (n = 3)

2.3 當(dāng)歸-苦參不同配伍改善心肌缺血的研究

SD大鼠ip 10%水合氯醛（3.0 mL/kg）麻醉，背位固定，穩(wěn)定15 min。將針形電極插入四肢皮下，連接多道生理記錄儀，描記肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖并以此為造模前心電圖，供造模后心電變化分析作參照。S D大鼠胸部去毛、消毒，沿左腋窩至第五肋骨與胸骨連接處切開皮膚約2 cm，順胸淺肌紋鈍性分離肌肉層。在第3、4肋間打開胸腔，撕開心包膜，距左心耳下緣2 mm處用6～0號眼科縫合線以0.3～0.5 mm深度結(jié)扎大鼠左前降支，復(fù)位心臟，迅速縫合胸腔[23]。記錄缺血后肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖，對比造模前心電圖，造模后大鼠心電圖ST段明顯上抬，為心肌缺血模型成功標(biāo)志[24]，如圖4。

圖4 當(dāng)歸-苦參不同配伍比例樣品的心電圖Fig.4 Electrocardiogram of samples of ASR-SFR with different compatibility ratios

將造完模的大鼠隨機(jī)分成對照組、模型組、當(dāng)歸組、當(dāng)歸-苦參藥對不同配伍組（1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1）、苦參組。按照配伍比例，分別準(zhǔn)確稱定當(dāng)歸、苦參藥材，加入30倍量70%乙醇，回流提取3次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至提取液無乙醇為止，置于4 ℃冰箱，備用。準(zhǔn)確按照大鼠給藥體積吸取藥液并ig，各藥對配比組給予2.7 g/(kg·d)（生藥量），對照組和模型組給予同體積去離子水。于造模第4天，連續(xù)ig給藥7 d。末次藥后1 h，用5 mL含肝素鈉的真空管腹主動脈采血，于4 ℃下3000 r/min離心（離心半徑10 cm）20 min，取上清，分裝于0.5 mL Eppendorf管中，?80 ℃冰箱保存，按照試劑盒操作說明對CK-MB、CK、LDH等血清酶學(xué)和IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的水平進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。與對照組比較，血清中CK、CKM、LDH、IL-1β、IL-6水平顯著升高（P＜0.01），不同配比藥對治療后，血清中CK、CK-M、LDH、IL-1β、IL-6水平顯著降低（P＜0.01），結(jié)果表明當(dāng)歸-苦參藥對可以改善心肌受損的情況。

2.4 PCA法綜合評價當(dāng)歸-苦參藥對不同配伍對心肌缺血大鼠的影響

將當(dāng)歸-苦參藥對化學(xué)成分含量測定結(jié)果（表4）和ELISA試劑盒測定結(jié)果（表5）用Excel 2020軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行PCA。

表5 血清生化指標(biāo)的測定 ( , n = 8)Table 5 Determination of serum biochemical indexes ( , n = 8)

表5 血清生化指標(biāo)的測定 ( , n = 8)Table 5 Determination of serum biochemical indexes ( , n = 8)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01**P ＜ 0.01 vs control group; #P ＜ 0.05 ##P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg?1)質(zhì)量濃度/(ng·L?1)CK CK-MB LDH IL-1β IL-6對照 ? 936.86±63.86 1.00±0.11 11.42±0.18 22.01±0.95 1.85±0.08模型 ? 2 210.12±122.76** 5.93±0.22** 24.15±0.85** 74.09±3.04** 3.23±0.13**當(dāng)歸 2.5 1 423.09±132.60## 4.74±0.65## 16.68±0.44## 32.51±1.27## 2.31±0.11##當(dāng)歸-苦參1∶1藥對 2.5 1 198.52±55.74## 2.77±0.15## 13.81±0.42## 32.87±1.26## 2.01±0.07##當(dāng)歸-苦參1∶2藥對 2.5 1 489.55±69.29## 3.65±0.49## 13.83±0.66## 36.45±1.50## 2.37±0.10##當(dāng)歸-苦參1∶3藥對 2.5 1 477.07±67.27## 2.36±0.24## 14.51±0.91## 30.95±2.00## 2.10±0.09##當(dāng)歸-苦參2∶1藥對 2.5 1 468.73±36.62## 3.07±0.29## 15.31±0.79## 43.25±2.01## 2.62±0.10##當(dāng)歸-苦參3∶1藥對 2.5 1 960.01±107.57## 3.94±0.21## 17.34±0.84## 41.94±2.09## 2.21±0.09##苦參 2.5 1 410.56±93.76## 4.38±0.48## 12.96±0.48## 33.82±1.95## 2.00±0.08##

2.4.1 PCA 為詳細(xì)地闡釋當(dāng)歸、苦參單味藥和不同配伍（1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1）藥對治療心肌缺血大鼠的差異，以藥對化學(xué)成分含量綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、藁本內(nèi)酯、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A、化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿、苦參酮、槐果堿、苦參堿和生化指標(biāo)CK、CK-MB、LDH、IL-1β、IL-6為分析數(shù)據(jù)源，應(yīng)用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和PCA，見圖5。11個化學(xué)成分和5個生化指標(biāo)變化的PCA結(jié)果見表6，以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到第1主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為8.473%和52.957%，第2主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為3.967%和24.796%，第3主成分的特征值和方差貢獻(xiàn)率分別為2.242%和14.010%，前3個成分的累積方差貢獻(xiàn)率已達(dá)到91.763%＞85%，因此，選取前3個主成分作為當(dāng)歸苦參藥對化學(xué)成分含量和生化指標(biāo)各指標(biāo)數(shù)據(jù)分析的有效成分，它代表了原有16個指標(biāo)變量的91.763%信息量，具有很好的代表性。

表6 當(dāng)歸-苦參化學(xué)成分和生化指標(biāo)的特征值和貢獻(xiàn)率Table 6 Characteristic value and contribution rate of chemical constituents and biochemical indexes of ASR and SFR

圖5 PCA載荷圖Fig.5 Loading plot of PCA

2.4.2 綜合評價模型構(gòu)建 由表7可知，可以用3個變量Z1、Z2、Z3代替原來的16個指標(biāo)對不同配比當(dāng)歸-苦參藥對進(jìn)行藥效綜合評價[25-27]，則得出線性組合（其中Y1～Y16均為標(biāo)準(zhǔn)化的變量）分別為Z1＝0.267Y1+0.276Y2+0.272Y3+0.256Y4+0.268Y5+0.295Y6+0.292Y7+0.306Y8+0.292Y9+0.313Y10+0.314Y11-0.082Y12-0.127Y13-0.172Y14-0.147Y15-0.136Y16；Z2＝0.138Y1+0.126Y2+0.071Y3+0.093Y4+0.119Y5+0.076Y6+0.100Y7+0.079Y8+0.070Y9+0.063Y10+0.057Y11+0.455Y12+0.388Y13+0.421Y14+0.432Y15+0.423Y16；Z3＝?0.298Y1-0.275Y2-0.352Y3-0.388Y4-0.353Y5+0.307Y6+0.256Y7+0.189Y8+0.331Y9+0.208Y10+0.234Y11+0.120Y12+0.059Y13-0.059Y14+0.093Y15-0.063Y16。

表7 主成分的載荷系數(shù)和特征向量Table 7 Load coefficients and eigenvectors of principal components

取第1～3主成分的方差貢獻(xiàn)率α1（52.957%）、α2（24.796%）、α3（14.010%）作為權(quán)數(shù)，Z1、Z2、Z3為特征向量因子，構(gòu)建綜合評價模型：F＝α1Z1+α2Z2+α3Z3，即F＝0.529 57Z1+0.247 96Z2+0.140 10Z3，式中F值為綜合評價指標(biāo)，應(yīng)用該模型結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)計算出當(dāng)歸苦參單味藥及其不同配伍治療心肌缺血大鼠的綜合評價F?？偟梅指叩头从沉水?dāng)歸-苦參藥對不同配比中化學(xué)成分及生化指標(biāo)綜合影響大小。

從表8中可以看出，隨著當(dāng)歸-苦參配比的不同變化，綜合指標(biāo)F值先增大后又逐漸降低，說明隨著當(dāng)歸-苦參配比的變化，心肌缺血大鼠有不同程度的改善，其中當(dāng)歸-苦參配比為1∶2時F值達(dá)到最高水平，說明當(dāng)歸-苦參配比為1∶2對于治療心肌缺血大鼠的療效較好。

表8 當(dāng)歸、苦參單味藥及其不同配伍治療心肌缺血大鼠的綜合評價 (F)Table 8 Comprehensive evaluation of single drug and its different compatibilities of ASR and SFR in treatment of myocardial ischemia in rats (F)

3 討論

本實(shí)驗通過Box-Behnken法優(yōu)選當(dāng)歸-苦參藥對的提取工藝，其法簡單可靠，首次對當(dāng)歸-苦參藥對的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取條件為料液比1∶30，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取次數(shù)為3次，每次1 h。在最佳提取條件下，通過雙波長HPLC法測定當(dāng)歸-苦參藥對不同配比中11個化學(xué)成分含量，并分析了不同配比下含量的變化。與當(dāng)歸-苦參0∶1比較，當(dāng)歸-苦參不同配比的（1∶1、2∶1、3∶1）樣品中隨著當(dāng)歸比例的升高，苦參中6種成分提取量呈“U”型分布；與當(dāng)歸-苦參1∶0比較，當(dāng)歸-苦參不同配比（1∶1、1∶2、1∶3）樣品中隨著苦參比例的升高，當(dāng)歸中5種成分提取量亦呈“U”型分布。且在當(dāng)歸-苦參1∶3時11個成分的含量最高。初步分析當(dāng)歸、苦參配比的升高，可能是通過改變整個溶劑系統(tǒng)的酸堿度和相關(guān)成分之間的協(xié)同作用，從而促使其不同配比化學(xué)成分的變化，具體機(jī)理有待進(jìn)一步深入研究。由此可見，藥對的相互配伍對其中的成分的確有一定影響。

本實(shí)驗通過PCA法，將藥對有效化學(xué)成分含量與血清生化16個單一指標(biāo)進(jìn)行整合，構(gòu)建成3個獨(dú)立的綜合變量，計算得出當(dāng)歸-苦參各配比的綜合指標(biāo)值，經(jīng)過加權(quán)進(jìn)行綜合評價，得出每一個配比的綜合療效排序。根據(jù)當(dāng)歸-苦參7個不同配比的綜合得分值F大小的排序，得出當(dāng)歸-苦參配比為1∶2時對于心肌缺血大鼠療效最好，1∶3次之，當(dāng)歸、苦參單位藥的改善程度最不明顯。

當(dāng)歸-苦參藥對在古方中出現(xiàn)頻次較高[28]，但其配伍相關(guān)的有效成分及治療心肌缺血的作用機(jī)制尚不明確。以上從化學(xué)層面和藥效學(xué)角度多方面分析藥對配伍機(jī)制，充分說明藥對配伍過程中不僅僅是單味藥之間簡單的加和，而是更為復(fù)雜的發(fā)生某種小分子化學(xué)反應(yīng)。本實(shí)驗未考察中藥材不同批次以及動物試驗中未設(shè)陽性藥組等問題，以上問題有待于繼續(xù)深入研究。本實(shí)驗首次對當(dāng)歸-苦參不同配比的配伍進(jìn)行化學(xué)成分和藥效學(xué)的研究，通過主成分分析法將單一的指標(biāo)進(jìn)行整合，篩選出對于治療心肌缺血大鼠的最佳配比可能為1∶2，此方法合理可靠，為后續(xù)當(dāng)歸-苦參藥對在臨床的應(yīng)用奠定了一定的科學(xué)依據(jù)，對將當(dāng)歸-苦參藥對開發(fā)為治療心血管的復(fù)方基礎(chǔ)具有指導(dǎo)意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突