王新輝

（華北制藥股份有限公司倍達(dá)分廠，河北 石家莊 052165）

0 引言

頭孢氨芐（Cefalexin） 為廣譜類抗生素，可以抑制細(xì)胞壁的合成，使細(xì)胞內(nèi)容物膨脹至破裂溶解，殺死細(xì)菌。為確保仿制藥與原研藥品質(zhì)量和療效一致，保證公眾用藥安全，中國(guó)開(kāi)始推行一致性評(píng)價(jià)工作，要求仿制藥廠家深入開(kāi)展對(duì)藥品的雜質(zhì)及質(zhì)量的研究工作。在《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版中頭孢氨芐采用梯度測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，能有效分離7- 氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（雜質(zhì)B 即7-ADCA） 和α- 苯甘氨酸（雜質(zhì)A） 等雜質(zhì)，但L- 頭孢氨芐不能基線分離。故通過(guò)對(duì)流動(dòng)相、梯度洗脫方法等進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測(cè)頭孢氨芐中L-頭孢氨芐的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器和材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀。

電子天平。

pH 計(jì)。

1.2 材料

L- 頭孢氨芐對(duì)照品，批號(hào)為2618-043A2。

頭孢氨芐對(duì)照品，批號(hào)為1304008-201411。

氫氧化鈉，AR 批號(hào)為20210107。

無(wú)水磷酸二氫鈉，AR 批號(hào)為P1533702。

甲醇，HPLC 批號(hào)為21105212。

2 方法優(yōu)化過(guò)程

經(jīng)查閱各國(guó)藥典，對(duì)比頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)所使用的方法，各國(guó)藥典有關(guān)物質(zhì)檢查方法所用色譜柱的種類相同，均為C18 柱；中國(guó)藥典和歐洲藥典（英國(guó)藥典） 所用流動(dòng)相緩沖鹽的pH 值、洗脫程序和檢測(cè)波長(zhǎng)相同，但緩沖鹽的種類和濃度不同；與美國(guó)藥典所用流動(dòng)相、洗脫程序和檢測(cè)波長(zhǎng)均不同。對(duì)各國(guó)藥典的有關(guān)物質(zhì)檢查方法進(jìn)行對(duì)比優(yōu)化，確定最佳檢測(cè)方法。

2.1 方法選擇

按照中國(guó)藥典、歐洲藥典（英國(guó)藥典） 和美國(guó)藥典的有關(guān)物質(zhì)檢查方法，分別配制供試品溶液和供試品溶液高溫破壞溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。美國(guó)藥典方法的靈敏度低，不采用，中國(guó)藥典和歐洲藥典高溫破壞溶液色譜圖如圖1 所示。

圖1 中國(guó)藥典和歐洲藥典高溫破壞溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms for high-temperature destruction solutions using Ch.P and EP method

由圖1 可看出，中國(guó)藥典方法主峰的分離度要優(yōu)于歐洲藥典方法，故在中國(guó)藥典頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)的方法上進(jìn)行優(yōu)化對(duì)L- 頭孢氨芐進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.2 流速選擇

在相同色譜柱、流動(dòng)相和柱溫條件下，分別設(shè)定流速為1.0 mL/min、1.2 mL/min 和1.5 mL/min，分別精密量取供試品高溫破壞溶液各20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。比較不同流速下雜質(zhì)的分離情況，不同流速下色譜圖如圖2 所示。

圖2 不同流速下色譜圖Fig.2 Chromatograms for Different flowvelocity

由圖2 可看出，流速1.5 mL/min 下主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度明顯優(yōu)于其他2 個(gè)流速，故方法選擇流速為1.5 mL/min。

2.3 緩沖鹽濃度選擇

在相同色譜柱、流速和柱溫條件下，分別配制0.05 mol/L、0.1 mol/L 和0.2 mol/L 的磷酸二氫鈉緩沖溶液（pH 值為5.0） 作為流動(dòng)相A，比較系統(tǒng)適用性溶液的分離情況，不同濃度流動(dòng)相A 系統(tǒng)適用性溶液色譜圖對(duì)比如圖3 所示。

圖3 不同濃度流動(dòng)相A系統(tǒng)適用性溶液色譜圖對(duì)比Fig.3 Comparison of system suitability chromatograms for different concentrations of mobile phase A

由圖3 可看出，緩沖鹽濃度為0.05 mol/L 時(shí)系統(tǒng)適用性溶液中主峰與后臨雜質(zhì)峰間不能達(dá)到分離要求，濃度為0.1 mol/L 和0.2 mol/L 時(shí)，主峰與相鄰雜質(zhì)峰之間均能達(dá)到分離要求。故確定0.1 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH 值為5.0） 作為有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)流動(dòng)相A。

3 方法確定

3.1 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（4.6*150 mm，5μm），以0.1 mol/L 磷酸二氫鈉（pH 5.0）為流動(dòng)相A，以甲醇為流動(dòng)相B，流速為1.5 mL/min，進(jìn)樣量為20μL，檢測(cè)器波長(zhǎng)為220 nm。梯度洗脫程序?yàn)椋?/p>

B/%梯度洗脫時(shí)間/min 0153742555660 A/%989370703098982730307022

3.2 溶液的制備

3.2.1 流動(dòng)相A

流動(dòng)相A 0.1 mol/L 磷酸二氫鈉（pH 值為5.0）溶液。以流動(dòng)相A 作為空白溶液。

3.2.2 L- 頭孢氨芐對(duì)照溶液

L- 頭孢氨芐對(duì)照溶液精密稱取L- 頭孢氨芐對(duì)照品約2.5 mg，置于5 mL 容量瓶中，使用流動(dòng)相A 稀釋并定容。移取上述溶液0.02 mL，置于5 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋并定容。

3.2.3 混合定位溶液

混合定位溶液取EP 雜質(zhì)A（α- 苯甘氨酸）對(duì)照品和雜質(zhì)B（7-ADCA） 對(duì)照品各5 mg，分別置兩個(gè)10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容。稱取頭孢氨芐對(duì)照品5 mg，置于5 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋并定容。取上述各對(duì)照品溶液各1.0 mL，置于同一50 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋并定容，作為有關(guān)物質(zhì)混合定位溶液。

3.2.4 雜質(zhì)混合定位溶液

雜質(zhì)混合定位溶液精密稱取L- 頭孢氨芐對(duì)照品約2.5 mg，置于5 mL 容量瓶中，使用流動(dòng)相A稀釋并定容。移取上述溶液0.02 mL，置于5 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋并定容。移取上述溶液0.1 mL 與“有關(guān)物質(zhì)混合定位溶液”0.1 mL 混合，作為雜質(zhì)混合定位溶液。

3.2.5 供試品溶液

供試品溶液取頭孢氨芐供試品10 mg，置100 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋并定容。

3.2.6 對(duì)照品溶液對(duì)照品溶液

精密量取供試品溶液1.0 mL 置于100 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相A 稀釋并定容。

3.2.7 供試品溶液高溫破壞

供試品溶液高溫破壞取供試品溶液適量，在80 ℃水浴中加熱60 min。

3.3 測(cè)定方法

測(cè)定方法按方法描述分別稱取L- 頭孢氨芐對(duì)照品溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，并分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，含L- 頭孢氨芐雜質(zhì)的量不得過(guò)0.2%。

4 方法驗(yàn)證

4.1 專屬性考察

取雜質(zhì)混合定位溶液和流動(dòng)相A（空白溶液）各10 μL，注入高效液相色譜儀，空白溶液在各目標(biāo)峰處無(wú)明顯干擾。雜質(zhì)混合定位溶液中各目標(biāo)峰的保留時(shí)間與加標(biāo)供試品溶液中的保留時(shí)間一致，主峰與相鄰雜質(zhì)分離度分別為2.27、3.26。均滿足專屬性要求。空白溶液色譜圖如圖4 所示。

圖4 空白溶液色譜圖Fig.4 Chromatograms of blank solution

圖5 L- 頭孢氨芐定位圖Fig.5 Chromatograms of Location map of L-Cefalexin

4.2 定量限/檢測(cè)限考察

儲(chǔ)備液：取L- 頭孢氨芐對(duì)照品2.5 mg，置于5 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。轉(zhuǎn)移上述溶液0.4 mL，置2 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。取頭孢氨芐對(duì)照品2.5 mg，置于5 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容，轉(zhuǎn)移上述溶液0.4 mL，置2 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。取上述兩溶液各0.3 mL，置同一10 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。

定量限溶液：取上述儲(chǔ)備液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。

檢測(cè)限溶液：取定量限溶液2.5 mL，置5 mL容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。

檢測(cè)結(jié)果：L- 頭孢氨芐信噪比S/N 為17.0 ～22.1，滿足信噪比≥10∶1 的要求，定量限濃度為0.3180 μg/mL，相當(dāng)于供試品的濃度百分比0.03%，連續(xù)進(jìn)樣6 針的RSD 為5.8%。

L- 頭孢氨芐信噪比S/N 為7.5，滿足信噪比≥3∶1 的要求，檢測(cè)限濃度為0.1590 μg/mL，相當(dāng)于供試品的濃度百分比0.02%，均滿足要求。

4.3 線性范圍

取定量限溶液0.4 mL，置于20 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。作為線性儲(chǔ)備溶液。

分別取線性儲(chǔ)備溶液0.5，1.0，1.5 和2.0 mL轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶中，并用流動(dòng)相A 稀釋定容。將定量限溶液及上述4 種溶液分別進(jìn)高效液相色譜儀，記錄色譜圖。L- 頭孢氨芐線性方程為：y=0.3022x- 0.0078，相關(guān)系數(shù)r 為0.9997。L- 頭孢氨芐濃度范圍：0.3180 ～2.1199 μg/mL，相當(dāng)于供試品的濃度百分比0.03%～0.21%。

4.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度儲(chǔ)備液：取定量限溶液0.4 mL，置于20 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相A 稀釋并定容。

精密稱取頭孢氨芐供試品10 mg 9 份置于10 mL 容量瓶中，分為以下3 組：

（1） 分別移取1.0 mL 定量限儲(chǔ)備液于容量瓶中，并用流動(dòng)相A 稀釋定容。

（2） 分別移取1.0 mL 準(zhǔn)確度儲(chǔ)備液于容量瓶中，并用流動(dòng)相A 稀釋定容。

（3） 分別移取1.5 mL 準(zhǔn)確度儲(chǔ)備液于容量瓶中，并用流動(dòng)相A 稀釋定容。

檢驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，LOQ 濃度水平加標(biāo)供試品平均回收率為93%～117%（n=3），回收率的RSD 為14%（n=3），其余水平加標(biāo)供試品溶液各水平的平均回收率均為113%～119%（n=3），回收率的RSD為2%～4%（n=3），符合要求。

4.5 重復(fù)性

精密稱取頭孢氨芐供試品10 mg 6 份置于10 mL 容量瓶中,并各轉(zhuǎn)移1 mL 準(zhǔn)確度儲(chǔ)備液于該容量瓶中，分別進(jìn)樣，計(jì)算6 份樣品中L- 頭孢氨芐含量的RSD 值，為2%，符合重復(fù)性的要求。

5 結(jié)語(yǔ)

本文參考各國(guó)藥典中頭孢氨芐有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法，通過(guò)一系列的試驗(yàn)研究及對(duì)方法的優(yōu)化，建立了梯度的方法對(duì)L- 頭孢氨芐的雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)對(duì)方法的專屬性、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度等進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法靈敏度好、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，能有效分析頭孢氨芐及其雜質(zhì)L-頭孢氨芐，為更好的控制頭孢氨芐中的雜質(zhì)提供了依據(jù)，可用于頭孢氨芐中L- 頭孢氨芐的檢測(cè)和對(duì)頭孢氨芐的質(zhì)量控制。