蒲艷芬 趙太均 許家倚 粟小娓 盧智琴 李云婷 陳玉皎，，3* 曹 軍*

（1貴州貴安精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)股份有限公司，貴州貴安 561113；2貴州航天智慧農(nóng)業(yè)有限公司，貴州貴陽 550081；3重慶大學(xué)生物工程學(xué)院生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市血管植入物工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044）

蛹蟲草是一種傳統(tǒng)中藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，蛹蟲草具有較高的藥用價(jià)值，其抗腫瘤作用在醫(yī)療及保健領(lǐng)域備受矚目[1]，并且被證明比冬蟲夏草具有更高的蟲草素和蟲草酸含量[2]。蛹蟲草活性成分包括麥角甾醇、蟲草酸、核苷和多糖[3?4]。據(jù)報(bào)道，不同類型的蛹蟲草提取物具有多種藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎和抗氧化活性等[5?7]。

癌癥是一種較為普遍的疾病，有較高的發(fā)病率和死亡率，對(duì)人類健康危害較大，現(xiàn)階段治療癌癥的主要方法有手術(shù)、化療和放療，但這些方法都存在各種局限性[8]。因此，尋找具有高效安全性的天然抗癌新藥，是預(yù)防或治療癌癥迫切需要。近年來，麥角甾醇和蟲草素抗癌作用的研究得到很好的發(fā)展。如真姬菇中分離出的麥角甾醇對(duì)小鼠皮膚癌有較好的治療作用[9]。此外，有研究篩選13個(gè)對(duì)11種細(xì)胞系有抗癌活性的藥用菌，發(fā)現(xiàn)皺蓋假芝提取物對(duì)癌癥的抑制效果最好。對(duì)皺蓋假芝提取物分離純化，發(fā)現(xiàn)其中的麥角甾醇能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡[10]。麥角甾醇與順鉑兩藥聯(lián)用能顯著抑制A549細(xì)胞增殖和遷移能力，阻滯細(xì)胞G2/M期分裂，誘導(dǎo)并激活PARP?1依賴的細(xì)胞凋亡[11]。LIN等[12]發(fā)現(xiàn)，麥角甾醇與兩性霉素B聯(lián)用，能夠有效地誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞壞死。麥角甾醇還可通過增高p21 m RNA和蛋白表達(dá)來抑制Hep G2細(xì)胞增殖等[13]。越來越多的研究表明蟲草素作為蟲草的一種生物活性化合物，在體外具有抗腫瘤作用[14?16]。蟲草素可以阻斷mTOR（雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo)）信號(hào)通路[17]，其通過調(diào)節(jié)AMPK/mTORC1信號(hào)通路，從而下調(diào)GBC?SD膽囊癌細(xì)胞中對(duì)HIF?1α的多種耐藥性[18]。

這一系列的研究表明，麥角甾醇和蟲草素的抗腫瘤作用明顯，且作用機(jī)制有所不同。筆者研究團(tuán)隊(duì)前期通過以家蠶蛹蟲草（海寧株）子實(shí)體為原料，采用工業(yè)色譜技術(shù)提取分離獲得的新構(gòu)像麥角甾醇，并研究證明該麥角甾醇不是通過提高免疫力發(fā)揮抗肺癌和肝癌作用[19?20]。

基于以上，筆者創(chuàng)新性地聯(lián)合采用家蠶蛹蟲草（海寧株）子實(shí)體中獲得的新構(gòu)像麥角甾醇和蟲草素聯(lián)用，初步考察其急性毒性，并進(jìn)一步構(gòu)建H22和Lewis荷瘤小鼠模型，研究其抗肺癌和肝癌的藥效，希望能夠?yàn)榉伟┖透伟┑乃幬镩_發(fā)提供良好的試驗(yàn)及應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

注射器（上海治宇醫(yī)療器械有限公司）；EL電子天平（常州天之平儀器設(shè)備有限公司）；超凈工作臺(tái)[力康精密科技（上海）有限公司]；組織勻漿器（濟(jì)南天方機(jī)械有限公司）。

Lewis肺癌瘤株（第5代）；H22肝癌瘤株（第3代）；C57 BL/6小鼠（18~22 g）（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2 012~0001，合格證號(hào)：11400700020779）、KM小鼠（18~22 g）（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2 012~0001，合格證號(hào)：11400700020779）[中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK（軍）2 012~0004）]；飼料（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK（軍）2 007~001）]；麥角甾醇、蟲草素（貴州貴安精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)股份有限公司采用自主培養(yǎng)的家蠶蛹蟲草（海寧株）子實(shí)體提取分離獲得，HPLC檢測(cè)純度分別為99.96%和99.98%）；環(huán)磷酰胺片（天津金世制藥有限公司，20130101）；吐溫80（北京博潤(rùn)萊特科技有限公司分裝）。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：普通級(jí)，室溫，常規(guī)飼喂。

1.2 藥物制備方法

麥角甾醇和蟲草素灌胃劑（混合藥物）：按3∶2稱取一定量的麥角甾醇和蟲草素樣品至研缽中，加入所需溶劑體積2%吐溫?80，充分研磨后再加入所需體積的生理鹽水，混勻后備用。

環(huán)磷酰胺灌胃劑：去掉環(huán)磷酰胺片的薄膜衣后，稱取一定量至研缽中，加入所需體積的生理鹽水，充分研磨、混勻后備用。

1.3 急性毒性試驗(yàn)

將50只試驗(yàn)小鼠共分為5組，每組10只，雌雄各半，分為①混合物高劑量組（11 g/kg）、②混合物中劑量組（5 g/kg）、③混合物中低劑量組（4 g/kg）、④混合物低劑量組（3 g/kg）、⑤空白組（2%吐溫80生理鹽水），以上各組小鼠空腹12 h后，按各組別給藥劑量灌胃給藥一次。觀察指標(biāo)：每日對(duì)各組小鼠進(jìn)行稱重、飲食量計(jì)算、是否有死亡及是否有中毒反應(yīng)的發(fā)生，并記錄，于第14天對(duì)各組小鼠進(jìn)行解剖觀測(cè)。

1.4 抑制肺癌和肝癌腫瘤生長(zhǎng)藥效試驗(yàn)

1.4.1 小鼠Lewis肺癌和H22肝癌荷瘤模型建立

取接種腫瘤8~13 d狀態(tài)良好的荷瘤小鼠脫臼處死，體表酒精消毒，在無菌（超凈臺(tái)）環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1∶3加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50 mL無菌離心管，備用。用1 mL注射器在C57（Lewis）和KM（H22）小鼠右腋下注射接種0.2 mL，腫瘤細(xì)胞混懸液的制備均在無菌條件下（超凈工作臺(tái)中）完成。從取出腫瘤腹水至腫瘤接種完畢在60 min內(nèi)完成。

1.4.2 分組及給藥方法

將60只試驗(yàn)小鼠共分為6組，每組10只，雌雄各半，分為①混合物低劑量（67 mg/kg）組、②混合物中劑量（200 mg/kg）組、③混合物高劑量（600 mg/kg）組、④環(huán)磷酰胺組、⑤模型組、⑥空白組，以上除空白組外，其余各組在注射腫瘤混懸液后，均每日給藥一次，每次每只0.2 mL，連續(xù)給藥10 d，空白組在相同給藥時(shí)間及給藥時(shí)長(zhǎng)灌胃給予2%吐溫?80水溶液，連續(xù)灌胃10 d。

1.4.3 肺和肝組織、瘤重和腫瘤抑制率的計(jì)算

每日觀察小鼠右腋下，于最后一次給藥24 h后，解剖并取出肺、肝稱重，解剖并取出腫瘤組織，稱重，并計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組別采用one?way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)

由表1可以初步推測(cè)，混合藥物給藥劑量為3~11 g/kg時(shí)，采用灌胃給藥方式，對(duì)小鼠的體重及飲食無影響（圖1）。

圖1 不同給藥劑量小鼠體重及飲食量變化

表1 混合藥物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

高劑量（11 g/kg）給藥量小鼠全部死亡，均在給藥后6 h內(nèi)死亡；中劑量（5 g/kg）給藥小鼠存活率為20%，1只為給藥13 d后死亡外，其余均在給藥后6 h內(nèi)死亡；中低劑量（4 g/kg）給藥小鼠存活率為30%，除2只為給藥2 d后死亡外，其余均在給藥后6 h內(nèi)死亡。對(duì)死亡小鼠的外觀及大體解剖可見圖2，各組別、各死亡時(shí)間小鼠均可見其胃部較為膨大且胃壁較薄，高劑量及中劑量組別小鼠外觀可見其四肢、口部暴露的皮膚呈現(xiàn)明顯紅色。由此推斷，其死亡原因可能由于所灌服藥劑對(duì)胃部產(chǎn)生較大的刺激性而使胃部出現(xiàn)較多的脹氣，引起胸部隔膜上升，胸腔空間縮小，導(dǎo)致呼吸困難而死亡。

圖2 解剖死亡的小鼠

在中毒反應(yīng)方面，給藥劑量為3~5 g/kg的小鼠均出現(xiàn)不同程度的中毒反應(yīng)，包括豎毛、困倦，涉及自主神經(jīng)系統(tǒng)及睡眠中樞系統(tǒng)。解剖給藥后14 d仍存活的小鼠，觀測(cè)其主要臟器，并未發(fā)現(xiàn)有明顯變化。

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，應(yīng)用Bliss方法計(jì)算聯(lián)合給藥的LD50，其結(jié)果為L(zhǎng)D50=3.98 g/kg。

2.2 聯(lián)合給藥的抗肺癌腫瘤作用

由表2、圖3結(jié)果可知，聯(lián)合給藥劑量為600 mg/kg，服藥10 d組與Lewis肺癌腫瘤模型小鼠比較有極顯著差異（P＜0.01），此劑量與環(huán)磷酰胺組比較無明顯差異，但腫瘤抑制率優(yōu)于環(huán)磷酰胺。除環(huán)磷酰胺組與模型組未出現(xiàn)肺癌轉(zhuǎn)移外，其余各組均出現(xiàn)10%~20%的肺癌轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 抗肺癌試驗(yàn)結(jié)果

表2 抗小鼠肺癌試驗(yàn)結(jié)果（±s）

表2 抗小鼠肺癌試驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組環(huán)磷酰胺組模型組劑量/（mg·kg?1）600 200 67 20存活率/%100 100 100 100 100小鼠凈體重變化/g?1.24±1.30?0.88±2.34 0.34±1.19?1.68±1.46*0.04±1.86肺重/g 0.18±0.04 0.19±0.03 0.17±0.03 0.16±0.02 0.21±0.13瘤重/g 0.52±0.29**0.76±0.39 0.79±0.27 0.59±0.29**1.04±0.50腫瘤抑制率/%50.05 26.11 23.78 42.85

環(huán)磷酰胺組小鼠出現(xiàn)體重下降，且與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）；600 mg/kg劑量組出現(xiàn)體重下降，與67 mg/kg劑量組比較有顯著差異（P＜0.05）；67 mg/kg劑量組體重上升，且與環(huán)磷酰胺組比較有極顯著差異（P＜0.01）。

2.3 聯(lián)合給藥抗肝癌腫瘤作用

由表3、圖4結(jié)果可知，聯(lián)合給藥劑量為600 mg/kg，服藥10 d組與H22肝癌腫瘤模型小鼠比較有顯著差異（P＜0.05），且在劑量為600 mg/kg時(shí)有較高的肝癌腫瘤抑制率（＞40%）；環(huán)磷酰胺組與模型組比較有極顯著差異（P＜0.01），劑量為600 mg/kg時(shí)與環(huán)磷酰胺組比較，腫瘤抑制率無明顯差異。

表3 抗小鼠肝癌試驗(yàn)結(jié)果（±s）

表3 抗小鼠肝癌試驗(yàn)結(jié)果（±s）

注：與模型組比較**P＜0.01，*P＜0.05。

組別高劑量組中劑量組低劑量組環(huán)磷酰胺組模型組劑量/（mg·kg?1）600 200 67 20存活率/%100 100 100 100 100凈體重變化量/g 4.67±4.65**6.19±3.37 5.60±2.53 3.22±3.12**8.11±4.66肝重/g 1.54±0.26*1.57±0.39 1.63±0.44 1.34±0.29**1.86±0.39瘤重/g 0.57±0.20*0.76±0.29 0.94±0.40 0.49±0.21**1.06±0.30腫瘤抑制率/%45.98 28.55 11.14 54.03

肝重方面，在劑量為600 mg/kg時(shí)，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），環(huán)磷酰胺組與模型組比較有極顯著差異（P＜0.01）。

凈體重變化方面，給藥劑量為600 mg/kg時(shí)及環(huán)磷酰胺組與模型組比較均呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。各組別小鼠均未出現(xiàn)癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

圖5 抗肝癌試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)

初步試驗(yàn)結(jié)果表明，在安全劑量范圍內(nèi)，家蠶蛹蟲草（海寧株）子實(shí)體中麥角甾醇與蟲草素聯(lián)合給藥具有抗小鼠肺癌腫瘤及肝癌腫瘤生長(zhǎng)的作用，為肺癌和肝癌藥物的開發(fā)及應(yīng)用建立良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

未來還需進(jìn)一步深入研究聯(lián)合給藥的抗腫瘤作用機(jī)制。此外，兩種抗腫瘤活性物質(zhì)聯(lián)合使用，是否可以減少對(duì)正常細(xì)胞的毒性和延緩耐藥性，從而達(dá)到更好的抗癌療效，仍在進(jìn)一步研究中。