董 笑，時(shí)安琪，耿 明

（1淮北師范大學(xué) 信息學(xué)院，安徽 淮北 235000；2安徽師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000）

0 引言

隨著人類基因組計(jì)劃研究的蓬勃發(fā)展，DNA 生物傳感器在基因測(cè)序、分子診斷和癌癥疾病早期診斷中發(fā)揮的作用也越來(lái)越大［1-3］.電化學(xué)DNA 生物傳感器的構(gòu)建一般是通過(guò)共價(jià)鍵合或者化學(xué)吸附作用，將敏感元件探針DNA 固定到電極表面，通過(guò)檢測(cè)雜交過(guò)程產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目標(biāo)DNA，具有制備簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高且穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn).

石墨烯特殊結(jié)構(gòu)使它具有優(yōu)良電學(xué)、光學(xué)、力學(xué)和熱學(xué)性質(zhì)，已經(jīng)作為一種良好的電化學(xué)傳感材料，廣泛用于傳感器的制備中.目前很多課題組已經(jīng)報(bào)道以石墨烯作為修飾電極的DNA生物傳感器［4-9］.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合納米金和石墨烯優(yōu)點(diǎn)，制備一種以金納米-石墨烯為傳感界面的電化學(xué)三明治型DNA生物傳感器.最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器擁有良好的分析性能及寬的線性響應(yīng)范圍（1.00×10-16mol·L-1~1.00×10-9mol·L-1）.該傳感器有望用于實(shí)際樣品的分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硫堇（上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）、還原石墨烯（rGO）（中科炭納米科技有限公司）、氯金酸（HauCl4·4H2O）（上?；瘜W(xué)試劑有限公司）、二烷基磺酸鈉（SDS）（中國(guó)天津阿法埃莎化學(xué)有限公司）、牛血清白蛋白（BSA,96%-99%）（鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司）、不同序列的DNA（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司中）.

CHI60C電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）.

掃描電子顯微鏡（SEM）（日本日立公司，JEOLJSM-4800F）.

探針DNA序列：5′-SH-（CH2）6-AAA ACC CTC CTC AAC CCC CT-3′.

信使DNA序列：5′-CCT CTA TAC CAA TTT CCA AAA-（CH2）3-3′.

目標(biāo)DNA序列：5′-TGG AAA TTG GTA TAG AGG AGG GGG TTG AGG AGG GT-3′.

單堿基錯(cuò)配序列：5′-TGG AAA TTG GTA TAG AGG AGG GGN TTG AGG AGG GT-3′（“N”代表堿基A，C或者T）.

完全不互補(bǔ)序列：5′-CAT GGC GGA AGC CGC TAC GTC CCC GGT CTA CAT TC-3′.

用pH7.4的0.01 mol·L-1磷酸緩沖溶液（PBS）配制不同序列的DNA，存于冰箱中待用.實(shí)驗(yàn)中DNA雜交時(shí)所用溶液為含有0.1 mol·L-1NaCl 的0.01 mol·L-1PBS（pH7.4），電化學(xué)檢測(cè)液為0.10 mol·L-1PBS（pH7.4），實(shí)驗(yàn)用水均為重蒸水.

三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極或修飾電極（Φ=3 mm），參比電極為飽和甘汞電極（SCE），對(duì)電極為鉑絲電極；

1.2 金納米粒子的合成

金納米粒子（Au NPs）的制備采用檸檬酸三鈉還原氯金酸法，具體過(guò)程如下：將置于圓底燒瓶中的1 mL氯金酸原液（質(zhì)量濃度為1 g·100 mL-1）與99 mL去離子水混合液體加熱至沸騰，迅速將4 mL新配制的檸檬酸三鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）溶液加入至燒瓶中，全程保持?jǐn)嚢?，直至溶液顏色逐漸由紫色變?yōu)榫萍t色.約15 min后停止加熱，將溶液冷卻至室溫，移至棕色廣口瓶中存放，置于冰箱中待用.

1.3 信使DNA-硫堇-金納米粒子復(fù)合物的制備

信使DNA-硫堇-金納米粒子復(fù)合物（rDNA-Thi-Au NPs）是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)容稍加修改制備而成［10］.將300 μL的信使DNA（1.00×10-5mol·L-1）加入到1.7 mL濃縮后的Au NPs溶液中，保持摩爾比（信使DNA：Au NPs）為150.在冰箱里混合放置24 h后，通過(guò)金-硫鍵的作用信使DNA連接在Au NPs上.然后加入含有0.1 mol·L-1NaCl（pH 7.4）的0.01 mol·L-1PBS緩沖溶液使其“老化”12 h.接著，將200 μL硫堇（0.1 mmol·L-1）加入到上述溶液中，室溫下低速攪拌24 h.最后，加入1.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA溶液用以封閉活性位點(diǎn).將制備好的復(fù)合物在16 000 r/min條件下離心10 min，將上層清液移除，用去離子水反復(fù)洗滌3次，最后分散在pH值為7.4的0.01 mol·L-1PBS緩沖溶液中（含0.1 mol·L-1NaCl）.

1.4 DNA生物傳感器的組裝

在制備修飾電極之前，需對(duì)玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理［11］.分別用不同粒度的α-Al2O3對(duì)裸玻碳電極拋光處理，然后分別在無(wú)水乙醇、丙酮和去離子水中超聲5 min，最后在氮?dú)鈿夥罩写蹈?

將0.5 mg·mL-1的還原石墨烯在乙醇溶液中進(jìn)行超聲，超聲均勻后，滴涂5.0 μL到預(yù)處理后的電極表面，室溫下晾干，在電極表面形成石墨烯薄膜（rGO）.將該電極置于1.0 mg·mL-1HAuCl4/0.10 moL·L-1NaNO3溶液中，-0.20 V條件下恒電位沉積20 s［12］，取出后用重蒸水沖洗3次，室溫晾干，獲得Au NPs-rGO修飾電極.

將5.0 μL濃度為1.00×10-5mol·L-1的探針DNA滴涂到構(gòu)建的修飾電極表面，4 ℃條件下放置2 h.然后將其浸泡到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% SDS 溶液中5 min，接著用重蒸水沖洗電極3次，完成探針DNA/金納米-石墨烯修飾電極（sDNA/Au NPs-rGO/GCE）的制備.

1.5 電化學(xué)檢測(cè)

首先，將不同濃度的目標(biāo)DNA 先與200 μL 負(fù)載到Au NPs 上的信使DNA 在37 ℃雜交液中雜交45 min［13］，然后將探針DNA/金納米-石墨烯修飾電極浸泡到含有目標(biāo)DNA 與信使DNA 的雜交液中，在37 ℃條件下雜交2 h.之后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% SDS 溶液和蒸餾水沖洗電極3 次，除去沒(méi)有雜交的目標(biāo)DNA與信使DNA.

采用差示脈沖伏安法（DPV）作為檢測(cè)手段，檢測(cè)液為0.10 mol·L-1PBS緩沖液（pH 7.4）.通過(guò)檢測(cè)雜交后硫堇產(chǎn)生的電流信號(hào)，發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)DNA雜交后硫堇的還原峰電流與目標(biāo)DNA濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，進(jìn)而可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器的制備原理

傳感器的構(gòu)建過(guò)程如圖1所示，還原石墨烯的存在增大電極的比表面積，加快電子的傳遞能力.納米金具有優(yōu)良的光電效應(yīng)，而且生物相容性好，可以通過(guò)金-硫鍵來(lái)固定一端修飾有巰基的探針DNA.同時(shí)制備一種信使DNA-硫堇-金納米粒子復(fù)合物，當(dāng)加入目標(biāo)DNA時(shí)，探針DNA與信使DNA可以和目標(biāo)DNA分段互補(bǔ)進(jìn)行雜交反應(yīng)，形成一種“夾心型”的結(jié)構(gòu).雜交后，連接在復(fù)合物上的硫堇也被修飾到電極表面，硫堇是一種電活性物質(zhì)，可以產(chǎn)生很強(qiáng)的電信號(hào)，并且目標(biāo)DNA的濃度越大，雜交的信使DNA的數(shù)量越多，接上的硫堇的量也越多，通過(guò)產(chǎn)生的電信號(hào)響應(yīng)值從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量檢測(cè).

圖1 DNA生物傳感器的構(gòu)建原理圖

2.2 金納米粒子-石墨烯/玻碳電極修飾電極的表征

本實(shí)驗(yàn)中，掃描電鏡（SEM）用來(lái)表征修飾電極材料，結(jié)果如圖2所示.圖2A清楚地顯示還原石墨烯光滑的褶皺片層結(jié)構(gòu).當(dāng)在其表面電沉積金納米粒子以后，可以看到金納米粒子大量地分布在電極表面（如圖2B所示）.

圖2 不同修飾電極的掃描電鏡圖

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中對(duì)信使DNA-硫堇-金納米粒子復(fù)合物中加入硫堇量以及雜交時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3 所示.當(dāng)加入的硫堇（0.01 mmol·L-1）體積從50 μL 增加到200 μL 時(shí)，硫堇的電信號(hào)響應(yīng)值是逐漸增大的（保持目標(biāo)DNA的濃度為一常量），當(dāng)硫堇體積超過(guò)200 μL時(shí)電流基本不再變化（如圖3A所示），表明硫堇與金納米粒子的結(jié)合量達(dá)到飽和.還對(duì)DNA 的雜交時(shí)間進(jìn)行考察，從圖3B 中可以看出雜交時(shí)間從0.5 h變化到2.0 h時(shí)，隨著雜交時(shí)間的增加，硫堇的信號(hào)值逐漸增大，2 h后峰電流值基本不再變化，所以選擇的最佳雜交時(shí)間為2 h.按照文獻(xiàn)［14-15］，選擇的金納米粒子最佳電沉積時(shí)間為20 s.檢測(cè)液pH 值為7.4，其原因是硫堇的信號(hào)強(qiáng)度與pH有關(guān)，它的電極反應(yīng)是一個(gè)2電子及2質(zhì)子的過(guò)程.同時(shí)，由于DNA在過(guò)高及過(guò)低的酸度條件下容易變性，因此選擇在生理pH條件下進(jìn)行測(cè)試，其pH值選擇7.4.

圖3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.4 分析性能

通過(guò)差示脈沖伏安法（DPV）檢測(cè)傳感器的分析性能.如圖4A所示，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，傳感器與不同濃度的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，結(jié)果表明檢測(cè)信號(hào)隨著DNA濃度的增大而增強(qiáng)，并且在目標(biāo)DNA濃度為1.00×10-16mol·L-1~1.00×10-9mol·L-1范圍內(nèi)，硫堇的電化學(xué)信號(hào)與DNA濃度的對(duì)數(shù)與呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖4B所示），線性回歸方程為I（μA）=202.9+11.97 log C（DNA濃度單位是mol·L-1），線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.998 9，檢測(cè)限達(dá)到3.5×10-17mol·L-1（信噪比為3）.說(shuō)明該生物傳感器具有良好的靈敏性.

圖4 傳感器的分析性能

2.5 選擇性

本實(shí)驗(yàn)中，還對(duì)傳感器的選擇性進(jìn)行考察.實(shí)驗(yàn)中選擇3種單堿基錯(cuò)配DNA、完全錯(cuò)配DNA以及完全互補(bǔ)DNA 序列分別與探針以及信使DNA 進(jìn)行雜交.雜交后歸一化的結(jié)果如圖5 所示，與單堿基錯(cuò)配DNA 雜交后電流值約是完全互補(bǔ)DNA 序列信號(hào)的40%，而完全錯(cuò)配DNA 雜交后信號(hào)響應(yīng)值最小，只有完全互補(bǔ)DNA 信號(hào)的6%.表明該生物傳感器選擇性好，可以很好地區(qū)分單堿基錯(cuò)配DNA 與完全互補(bǔ)DNA.

圖5 傳感器與不同DNA序列雜交后的電流值的歸一化圖

3 結(jié)論

本文構(gòu)建一種基于金納米粒子-石墨烯的修飾電極，該修飾電極具有高的比表面以及很好地導(dǎo)電性.同時(shí)，制備一種信使DNA-硫堇-金納米粒子-復(fù)合物，通過(guò)檢測(cè)硫堇的電信號(hào)值實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的定量分析.該生物傳感器制備過(guò)程簡(jiǎn)單，靈敏度較高，選擇性好，為其他高靈敏生物傳感器的制備提供思路.