汪文濤,米旭光,周 陽,蒲文星,高佳旭,景 猛,孟繁凱

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院外科學(xué)，吉林 長春 130117；2.吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130021；3.吉林釋然司法鑒定中心法醫(yī)組，吉林長春 130022；4.吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021）

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，無論是腦外傷（例如慢性硬膜下血腫、慢性硬膜外血腫和腦挫裂傷等）還是慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ɡ缗两鹕『桶柎暮Ｄ〉龋?］均存在不同程度的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷。神經(jīng)細(xì)胞損傷會(huì)影響神經(jīng)系統(tǒng)，患者會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的肢體活動(dòng)和感覺障礙，影響患者的日?；顒?dòng)。自噬是一種將細(xì)胞中損傷的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)呈遞到溶酶體中進(jìn)行消化降解和實(shí)現(xiàn)物質(zhì)代謝需要的過程，目的是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身的內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞器的更新［2］。當(dāng)細(xì)胞受到缺血、缺氧和能量供應(yīng)障礙等應(yīng)激刺激時(shí)，原本平衡的自噬功能被破壞［3］，細(xì)胞就會(huì)發(fā)生氧化損傷，甚至死亡。自噬不足會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中有害物質(zhì)得不到及時(shí)的清理，繼而加重細(xì)胞損害，自噬過度又會(huì)導(dǎo)致自噬體可能過度吞噬包裹正常功能的細(xì)胞器，亦會(huì)加重細(xì)胞損傷［4］。有研究［5］顯示：在神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中機(jī)體的細(xì)胞通過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）外泌體（exosomes，Exo）激活自噬，增強(qiáng)細(xì)胞自噬可明顯減輕神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷，同時(shí)降低細(xì)胞死亡率。BMSCs及其外泌體在神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)中均發(fā)揮重要作用，BMSCs來源Exo（BMSCs-Exo）對SH-SY 5Y細(xì)胞的影響一方面是通過改變神經(jīng)細(xì)胞所處的微環(huán)境，另一方面是將功能性的miRNA和蛋白質(zhì)傳遞給神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)元重塑，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)功能恢復(fù)［6］。

本研究采用已1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridine ion，MPP+）誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY 5Y細(xì)胞存活率降低的相關(guān)模型，探討B(tài)MSCs-Exo抵抗細(xì)胞存活率下降的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器BMSCs和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY 5Y細(xì)胞為吉林省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。DMEM-HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基（SH 30022.01）購自美國Hyclone公司，雷帕霉素（rapamycin，Rap）和胰蛋白酶（FG301-01）購自美國TRANS公司，3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）、胎牛血清（FB15015）購自美國CLARK公司，雙抗（HY-K1006）購自美國MedChemExpress公司，無血清培養(yǎng)基（#05445）和無血清消化液（#05426）購美國自STEMCELL公司，無血清凍存液（05-713-1）購自美國BI公司，MPP+（N137206）和二甲基亞砜（D103280）購自美國Aladdin公司，噻唑蘭［3-（4，5）-dimethylthiahiazo （ -2-y-l） -3， 5-di-phenytetra zoliumromide，MTT］（M 8180）購自美國Solarbio公司，吖啶橙（A 60114）購自美國Sigma公司。超凈臺（1300 SERIES A 2）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo3111）、高速離心機(jī)（Thermo-hera）和酶標(biāo)儀（Multiskan Mk3）購自美國Thermo公司，低速離心機(jī)（SC-3616）購自安徽ZONKIA公司，－80℃冰箱（DW-861500）購自青島澳柯瑪股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組將人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY 5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天倒置光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞長至80%～90%融合度時(shí)，采用胰酶進(jìn)行消化傳代。將細(xì)胞鋪于96孔板或6孔板。

實(shí)驗(yàn)分為對照組［給予相應(yīng)容積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）］、MPP+組（給予0.50 mmol·L－1MPP+）、MPP++BMSCs培養(yǎng)上清液（BMSCs-Sup）組（給予0.50 mmol·L－1MPP+和BMSCs-Sup）、MPP++BMSCs-Exo組（給予0.50 mmol·L－1MPP+和100 mg·L－1BMSCs-Exo）、MPP++Rap組（給 予0.50 mmol·L－1MPP+和2μmol·L－1Rap）和MPP++BMSCs-Exo+3-MA組（給 予0.50 mmol·L－1MPP+、100 mg·L－1BMSCs-Exo和1 mmol·L－13-MA）。處理48 h后采用相應(yīng)試劑盒行相關(guān)檢測。BMSCs培養(yǎng)、傳代采用無血清培養(yǎng)體系，步驟參照試劑說明書。

1.3 Exo的提取和檢測無血清培養(yǎng)BMSCs：收集BMSCs指數(shù)增長期的培養(yǎng)液，在BMSCs指數(shù)增長期收集培養(yǎng)上清液，2 500 r·min－1離心5 min，收集上清。MPP++BMSCs-Sup組細(xì)胞加入BMSCs培養(yǎng)上清液。50%體積比的上清培養(yǎng)液含1體積SH-SY 5Y細(xì)胞正常培養(yǎng)液和1/2體積干細(xì)胞培養(yǎng)上清液。BMSCs-Exo提?。捍鼴MSCs生長至80%時(shí)，于2℃－6℃以3 000 g離心10 min，收集上清。采用外泌體提取試劑盒說明書方法收集Exo。Exo的定量：采用BCA法，依據(jù)全式金蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書的步驟對收集的Exo進(jìn)行蛋白定量。

1.4 MTT法檢測各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率將SH-SY 5Y細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔5 000個(gè)細(xì)胞。采用不同濃度（0、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol·L－1MPP+作用于SH-SY 5Y細(xì)胞24和48 h，檢測細(xì)胞存活率。培養(yǎng)48 h后，采用MPP+、0.50 mmol·L－1MPP++BMSCs-Sup（體 積 比 為50%）或0.50 mmol·L－1MPP++100 mg·L－1BMSCs-Exo分別作用于SH-SY 5Y細(xì)胞。達(dá)到所需的加藥時(shí)間后，每孔加入5 g·L－1MTT溶液20μL，37℃孵育4 h后，棄上清，每孔加入100μL DMSO，低速震蕩10 min，采用酶標(biāo)儀于492 mm處檢測每孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（加藥處理組A值－空白對照孔A值）/（對照組A值－空白對照孔A值）×100%。

1.5 吖啶橙染色觀察各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度SH-SY 5Y細(xì)胞以每孔1×106個(gè)的密度接種于6孔板中；24 h后去除培養(yǎng)基，加入含有0.50 mmol·L－1MMP+的培養(yǎng)基（含上清）。作用48 h后，分別加入Rap和3-MA作用6 h。吸去培養(yǎng)基，采用PBS洗滌細(xì)胞3次，然后采用1μg·L－1吖啶橙染色15 min，采用PBS洗滌3次，每次3～5 min，洗滌后采用4%多聚甲醛固定10 min，再次洗滌3次，在載玻片上滴加1滴VECTOR防熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片，在共聚焦顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度。

1.6 Western blotting法檢測BMSCs-Exo相關(guān)蛋白表達(dá)情況將20μg蛋白質(zhì)樣品置入12%SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)膜50 min，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，分別加入1∶1 000稀釋的Calnexin抗體、TSG101抗體和CD63抗體，4℃環(huán)境輕搖過夜。次日經(jīng)TBST洗脫抗體后，分別加入1∶2 000比例稀釋的二抗室溫下孵育2 h，采用TBST漂洗3次；將PVDF膜浸泡于顯影液中顯影曝光，UVP凝膠成像分析儀中采集圖像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graphpad Prism version 8.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率和SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用SNKq檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率在SH-SY 5Y細(xì)胞中加入不同濃度（0、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol·L－1）MPP+孵育24或48 h后檢測結(jié)果顯示：與0μmol·L－1MPP+組比較，在相同處理時(shí)間下，隨著MPP+濃度的增加，SH-SY 5Y細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。在相同濃度MPP+作用下，隨著作用時(shí)間的延長，SH-SY 5Y細(xì)胞存活率逐漸降低（P＜0.05），呈時(shí)間依賴性。見圖1和2。

圖1 不同濃度MPP+作用24h各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率Fig.1 Survival rates of SH-SY 5Y cells in various groups after treated with different concentrations of MPP+for 24 h

圖2 不同濃度MPP+作用48 h各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率Fig.2 Survival rates of SH-SY5Y cells in various groups after treated with different concentrations of MPP+for 48 h

2.2 BMSCs-Sup作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率和自細(xì)胞中噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度與對照組（僅加入PBS）比較，MMP+組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與MMP+組比較，MMP++BMSCs-Sup組SH-SY5Y細(xì)胞存活率降低（P＜0.05），見圖3。共聚焦顯微鏡下觀察酸性泡狀細(xì)胞器：正常細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后在熒光顯微鏡下可見綠色熒光和暗紅色熒光，當(dāng)細(xì)胞自噬水平增加時(shí)，紅色熒光增強(qiáng)。與MMP+組比較，BMSCs-Sup組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05）。見圖4和5。

圖3 BMSCs-Sup作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率Fig.3 Survival rates of SH-SY5Y cells in various groups after treated with BMSCs-Sup

圖4 BMSCs-Sup作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡的形態(tài)表現(xiàn)(吖啶橙，Bar=100μm)Fig.4 Morphology of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with BMSCs-Sup（Acridine orange,Bar=100μm)

圖5 BMSCs-Sup作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence intensities of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with BMSCs-Sup

2.3 BMSCs-Exo作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)、細(xì)胞存活率和細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度Western blotting法檢測結(jié)果顯示：Exo標(biāo)記蛋白CD63和TGS101蛋白高表達(dá)，但Calnexin蛋白不表達(dá)，符合BMSCs-Exo的特性，見圖6。MTT檢測結(jié)果顯示：加入BMSCs-Exo后，與MPP+組比較，MPP++BMSCs-Exo組細(xì)胞存活率升高，見圖7。共聚焦顯微鏡下觀察自噬酸性泡狀細(xì)胞器結(jié)果顯示：與MPP+組比較，加入BMSCs-Exo的MPP++BMSCs-Exo組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05）。見圖8和9。

圖6 BMSCs-Exo作用后SH-SY 5Y細(xì)胞中CD63、TGS101和Calnexin蛋白表達(dá)電泳圖Fig.6 Electrophoregram of expressions of CD63,TGS101,and Calnexin proteins in SH-SY 5Y cells after treated with BMSCs-Exo

圖7 BMSCs-Exo作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率Fig.7 Survival rates of SH-SY5Y cells in various groups after treated with BMSCs-Exo

圖8 BMSCs-Exo作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡的形態(tài)表現(xiàn)(吖啶橙，Bar=100μm)Fig.8 Morphology of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with BMSCs-Exo（Acridine orange,Bar=100μm)

圖9 BMSCs-Exo作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中酸性囊泡熒光強(qiáng)度Fig.9 Fluorescence intensities of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with BMSCs-E xo

圖11 3-MA作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率Fig.11 Survival rates of SH-SY 5Y cells in various groups after treated with 3-MA

2.4 Rap或3-MA作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率和細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度MTT法檢測結(jié)果顯示：與MPP+組比較，MPP++BMSCs-Exo組和MPP++Rap組細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.05）。與MPP++BMSCs-Exo組比較，MPP++BMSCs-Exo+3-MA組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），見圖10和11。共聚焦顯微鏡下觀察酸性泡狀細(xì)胞器結(jié)果顯示：與MPP+組比較，MPP++BMSCs-Exo組、MPP++Rap組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡數(shù)明顯增加，細(xì)胞中酸性囊泡熒光強(qiáng)度升高（P＜0.05），見圖12和13。與MPP++BMSCs-Exo組比較，MPP++BMSCs-Exo+3-MA組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡數(shù)明顯減少，細(xì)胞中酸性囊泡熒光強(qiáng)度明顯降低（P＜0.05）。見圖14和15。

圖10 Rap作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞存活率Fig.10 Survival rates of SH-SY 5Y cells in various groups after treated with Rap

圖12 Rap作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡的形態(tài)表現(xiàn)(吖啶橙，Bar=100μm)Fig.12 Morphology of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with Rap(Acridine orange,Bar=100μm)

圖14 3-MA作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞自噬酸性囊泡的形態(tài)表現(xiàn)(吖啶橙，Bar=100μm)Fig.14 Morphology of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with 3-MA(Acridine orange,Bar=100μm)

3 討 論

圖13 Rap作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡熒光強(qiáng)度Fig.13 Fluorescence intensities of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with Rap

骨髓來源的Exo是BMSCs分泌的一組重要的信號納米囊泡，是一種新的、多靶點(diǎn)的下一代生物制劑，可能是下調(diào)細(xì)胞因子風(fēng)暴和逆轉(zhuǎn)新型冠狀病毒肺炎特征的宿主抗病毒防御抑制的關(guān)鍵［7-8］；其包含大量的趨化因子生長因子mRNA和微小RNA（microRNA，miRNA），miRNA具有抗炎、再生和免疫調(diào)節(jié)作用功能，Exo是旁分泌和內(nèi)分泌介質(zhì)，賦予BMSCs其治療特性，其具有優(yōu)越的安全性、穩(wěn)定性和可擴(kuò)展性，這些使Exo成為可靠的和實(shí)用的治療細(xì)胞損傷的物質(zhì)［9］。BMSCs在神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮重要作用，但存在著移植后不能準(zhǔn)確到達(dá)作用部位，而且某些患者存在免疫排斥、細(xì)胞去分化和惡性腫瘤形成等風(fēng)險(xiǎn)［10］。Exo是由細(xì)胞分泌產(chǎn)生的脂質(zhì)雙分子層膜囊泡，在機(jī)體多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用，是近些年來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題［11］。Exo能夠參與腦損傷等發(fā)生后的血管新生、神經(jīng)再生和突觸可塑性等諸多病理過程，其中miRNA介導(dǎo)的信號通路在神經(jīng)退行性疾病的大腦修復(fù)過程中起關(guān)鍵性作用［12］。體內(nèi)移植BMSCs-Exo還可以可減少細(xì)胞凋亡、減輕炎癥和增強(qiáng)細(xì)胞活力，從而有助于損傷細(xì)胞的修復(fù)。

本研究探討B(tài)MSCs-Exo抵抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY 5Y細(xì)胞存活率下降的機(jī)制，結(jié)果顯示：BMSCs-Exo能夠抵抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY 5Y細(xì)胞存活率下降。目前已有研究［13］顯示：BMSCs對相關(guān)細(xì)胞及組織具有修復(fù)作用，BMSCs-Exo可有效促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）大鼠的軟骨修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)合成，以及減輕膝關(guān)節(jié)疼痛；BMSC-Exo也可減少小鼠的光老化和炎癥，這可能有助于預(yù)防和治療皮膚老化［14］。

BMSCs-Exo的提取通過聚合物的沉淀法從BMSCs-Sup中分離Exo。其鑒定可以通過蛋白質(zhì)印跡等方法鑒定BMSCs-Exo，Exo裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析顯示外泌體表面標(biāo)志物［7］。有研究［8］顯示：CD63和TSG101表達(dá)增強(qiáng)，Exo分泌增多，當(dāng)CD63和TSG101表達(dá)減弱時(shí)，Exo分泌明顯減少，CD63和TSG101可作為鑒定Exo標(biāo)志蛋白。本研究結(jié)果顯示：Exo表面標(biāo)志物CD63和TSG101呈陽性表達(dá)，而未檢測到Calnexin，表明BMSCs-Exo與BMSCs-Sup成功分離，BMSCs-Exo成功分離。

圖15 3-MA作用后各組SH-SY 5Y細(xì)胞中自噬酸性囊泡的熒光強(qiáng)度Fig.15 Fluorescence intensities of autophagic acidic vesicles in SH-SY 5Y cells in various groups after treated with 3-MA

在真核細(xì)胞中，自噬是一種高度受控的溶酶體介導(dǎo)的功能消除損壞或老化的長壽蛋白質(zhì)和細(xì)胞器。這是修復(fù)所需要的多重脅迫下細(xì)胞存活的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［15］。細(xì)胞自噬情況的檢測可以通過共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞中自噬酸性囊泡的熒光強(qiáng)度，自噬溶酶體由自噬體和溶酶體融合形成，是一種酸性囊泡細(xì)胞器，吖啶橙是一種熒光染料，在自噬溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶活性增強(qiáng)的情況下顯著著色［16］。本研究通過吖啶橙對細(xì)胞進(jìn)行染色，在共聚焦顯微鏡下觀察自噬酸性囊泡的熒光強(qiáng)度，本研究結(jié)果顯示：BMSCs-Exo在提高細(xì)胞存活率和調(diào)節(jié)自噬方面有獨(dú)特的功能。

綜上所述，在SH-SY 5Y細(xì)胞存活率降低時(shí)，BMSCs-Exo可以誘導(dǎo)SH-SY 5Y細(xì)胞自噬，從而抵抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞存活率下降，提高細(xì)胞存活率并促進(jìn)損傷細(xì)胞的修復(fù)，對神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療有一定的指導(dǎo)意義。