張海艷，劉 芳，姜旭芳

（洛陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471934）

蠟樣芽孢桿菌屬芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬[1]，是兼性需氧性革蘭氏陽性菌[2]。蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢時對高溫、高酸和高堿產(chǎn)生很強的抗逆性，對部分抗生素產(chǎn)生一定的耐受性[3]。抗生素的過量使用及畜牧產(chǎn)品藥物殘留對環(huán)境的污染，導(dǎo)致越來越多的細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生了耐藥性，如何利用生物防治避免化學(xué)防治的弊端成為當(dāng)今的熱點問題之一[4]，無毒、無害的微生態(tài)制劑（將有益微生物經(jīng)鑒定、篩選、發(fā)酵培養(yǎng)等制成的一種活菌制劑[5]）逐漸被大量研究。目前大多數(shù)益生菌抗逆性差，耐高溫及酸堿的能力弱，添加在飼料中無法保證產(chǎn)品的有效性。芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，抗逆性強，可彌補益生菌的不足，抗性及產(chǎn)孢條件是芽孢桿菌研究的熱點[6]。無毒的蠟樣芽孢桿菌是一種對宿主有益的益生菌，生長繁殖過程中產(chǎn)生的大量營養(yǎng)物質(zhì)，通過改善腸道微生態(tài)環(huán)境、增強機體免疫力防治疾病、促進(jìn)動物生長發(fā)育[7-8]，利用自身產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)殺死細(xì)菌，不會使細(xì)菌產(chǎn)生耐受性，不會給環(huán)境帶來毒害殘留物，減輕了環(huán)境污染。蠟樣芽孢桿菌耐高溫、耐高酸、耐高堿，能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率及利用率，是一種理想的動物飼料添加劑，同時在人體保健醫(yī)療、植物生長促進(jìn)劑等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力較大[9]。

微生態(tài)制劑的應(yīng)用要考慮菌株能否通過胃酸的消化，飼料加工時高溫能否殺死菌株及菌株產(chǎn)生最佳作用效果的培養(yǎng)條件。本研究基于以上問題，探究了蠟樣芽孢桿菌的生長特性、耐酸堿性、耐高溫性、對抗生素的耐受性及實現(xiàn)最大生物產(chǎn)量的培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：蠟樣芽孢桿菌由洛陽師范學(xué)院生命科學(xué)院動物營養(yǎng)與健康研究室提供。培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)配制[10-11]。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 將冷藏保存的蠟樣芽孢桿菌用接種環(huán)在LB固體培養(yǎng)基表面劃線，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

1.2.2 種子液制備 吸取1 ml菌液，12 000 r/min離心2 min，棄上清液，加1 ml PBS搖勻后離心2 min，棄上清液，加1 ml PBS搖勻后，用酶標(biāo)儀測OD值，以O(shè)D600值=0.5的菌液為種子液。

1.2.3 生長曲線繪制 取種子液以1%的量接種至LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、轉(zhuǎn)速220 r/min的搖床中培養(yǎng)8 h后測OD600值，之后每隔4小時吸取1 ml菌液測OD600值，繪制菌種生長曲線。

1.2.4 活菌及芽孢測定方法 活菌：傾注法活菌計數(shù)[12]。芽孢：培養(yǎng)菌液80 ℃水浴加熱10 min，充分滅活營養(yǎng)體菌體細(xì)胞后以傾注法進(jìn)行活菌計數(shù)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線

0～16 h蠟樣芽孢桿菌生長較快，以對數(shù)的方式增值；16～24 h菌株新增和死亡達(dá)到平衡，蠟樣芽孢桿菌生長基本進(jìn)入穩(wěn)定期；24 h后蠟樣芽孢桿菌進(jìn)入衰亡期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣消耗導(dǎo)致菌株消亡，菌株數(shù)不斷減少（圖1）。

圖1 蠟樣芽孢桿菌生長曲線

2.2 溫度對活菌數(shù)和存活率的影響

隨著溫度的升高，活菌數(shù)逐漸下降，但蠟樣芽孢桿菌的存活率較高，以37 ℃為空白對照，在90 ℃和100 ℃的高溫下處理10 min，存活率分別達(dá)83.7%和83.4%，說明蠟樣芽孢桿菌耐高溫（圖2）。

圖2 溫度對活菌數(shù)和存活率的影響

2.3 pH對活菌數(shù)和存活率的影響

以pH=7為空白對照，pH值分別為2、9時，蠟樣芽孢桿菌的存活率均在80%以上，說明蠟樣芽孢桿菌耐酸堿（圖3）。動物胃腸道的pH值為2～3，小腸的pH值為5～7，動物飼料的pH值為6.2～6.8，均對蠟樣芽孢桿菌的生長影響不大。

圖3 pH對蠟樣芽孢桿菌活菌數(shù)和存活率的影響

2.4 培養(yǎng)時間對蠟樣芽孢桿菌生長和產(chǎn)孢率的影響

活菌數(shù)和芽孢數(shù)都隨培養(yǎng)時間先增加后減少，且都在24 h達(dá)到最佳，此時產(chǎn)孢率為93.1%，所以24 h為蠟樣芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)時間（圖4）。

圖4 培養(yǎng)時間對蠟樣芽孢桿菌 生長和產(chǎn)孢率的影響

2.5 初始pH值對蠟樣芽孢桿菌生長和產(chǎn)孢率的影響

初始pH=7.5時，蠟樣芽孢桿菌活菌數(shù)最多，但此時芽孢數(shù)不是最多；初始pH=6.5時，芽孢數(shù)最多且產(chǎn)孢率最高（圖5）。因此，最佳初始pH值為6.5。

圖5 初始pH值對蠟樣芽孢桿菌 生長和產(chǎn)孢率的影響

2.6 裝液量對蠟樣芽孢桿菌生長和產(chǎn)孢率的影響

蠟樣芽孢桿菌為好氧菌，裝液量少時通氣量大、氧氣含量高，有利于菌株生長和芽孢形成。裝液量為25 ml時活菌數(shù)、芽孢數(shù)和產(chǎn)孢率均達(dá)到最大，因此裝液量以25 ml為最佳（圖6）。

圖6 裝液量對蠟樣芽孢桿菌生長和產(chǎn)孢率的影響

2.7 蠟樣芽孢桿菌對抗生素的耐受性

由表1可知，蠟樣芽孢桿菌對赤霉素有高濃度的耐受性，對硫酸卡那霉素和硫酸鏈霉素有低濃度的耐受性。在飼料中添加上述抗生素不會抑制菌株的作用效果。

表1 蠟樣芽孢桿菌對抗生素的耐受性

3 結(jié)論與討論

蠟樣芽孢桿菌具有很好的抗逆性，對赤霉素、硫酸鏈霉素、硫酸卡那霉素均具有一定的耐受性，其最佳產(chǎn)孢條件為培養(yǎng)溫度37 ℃、培養(yǎng)時間24 h、初始pH值6.5、裝液量25 ml；蠟樣芽孢桿菌可作為生物制劑添加在動物飼料中。

蠟樣芽孢桿菌作為微生態(tài)制劑應(yīng)用十分廣泛，作為飼料添加劑改變了凡納濱對蝦腸道微生物的組成，提高了對蝦的生長速度[14]。劉一塵等[15]認(rèn)為蠟樣芽孢桿菌能夠促進(jìn)動物消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率及利用率。陳旭東等[16]研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生細(xì)菌素和拮抗致病菌。雖然強調(diào)以活的菌種添加在動物飼料中，但實際應(yīng)用中多為芽孢桿菌的死菌，目前死菌與活菌的作用效果是否一致，不同微生物制劑的添加量是否會引起不同的效果，模擬酸度與動物胃酸的效果是否一致等問題仍需進(jìn)一步研究和探討。