鄧莎莎，徐志豪，胡 婧，金騰川

(中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，合肥 230000)

新冠病毒(SARS-CoV-2)通過(guò)呼吸道顆粒在人與人之間傳播，感染后表現(xiàn)為從無(wú)癥狀到呼吸衰竭、多器官功能障礙甚至死亡的一系列臨床反應(yīng)[1-3]。盡管新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的病死率低于嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)和中東呼吸綜合征(MERS)，但其傳染性遠(yuǎn)高于季節(jié)性流感[4-5]。

新冠病毒是一種正義單鏈RNA冠狀病毒，其基因組由14個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)組成，編碼27個(gè)蛋白，主要的結(jié)構(gòu)蛋白有刺突蛋白(spike protein，S蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)、核衣殼蛋白(nucleocapsid，N蛋白)[6]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)是新冠病毒的主要宿主細(xì)胞受體，在人肺上皮中大量表達(dá)，通過(guò)與新冠病毒上刺突蛋白的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(receptor binding domain，RBD)的相互作用介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞[7]，因此肺是受新冠病毒影響最大的器官[8]。與其他冠狀病毒相比，新冠病毒與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2的結(jié)合親和力高10～20倍，這也是導(dǎo)致新冠病毒傳播迅速的原因之一[9]。

抗體反應(yīng)與疫苗研發(fā)息息相關(guān)，相關(guān)研究如特異性抗體和康復(fù)患者血漿等方法作為治療方案正在開(kāi)發(fā)中[10-11]。有研究表明使用針對(duì)新冠病毒刺突蛋白的單克隆中和抗體可以保護(hù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免受高劑量病毒的侵害[12]。然而，大約30%的康復(fù)期患者體內(nèi)幾乎不存在新冠病毒中和抗體，這表明有其他免疫機(jī)制參與了病毒清除[13]。除此之外，與特異性抗體短效性相比，新冠特異性CD8+T細(xì)胞相對(duì)持久且保持穩(wěn)定，在感染12個(gè)月后仍被檢測(cè)到[14-16]，這也進(jìn)一步表明T細(xì)胞在對(duì)抗新冠病毒的免疫記憶中的重要性，并且可能介導(dǎo)長(zhǎng)期的抗病毒保護(hù)[17-19]。有研究通過(guò)冠狀病毒特異性CD8+T或CD4+T細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移降低了肺中的病毒滴度并提高了小鼠的存活率，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞即使在沒(méi)有抗體或先天免疫系統(tǒng)激活的情況下也足以清除病毒[20]。新冠患者T細(xì)胞主要分為活化和耗竭兩種表型，在新冠患者中大多表現(xiàn)出淋巴細(xì)胞減少的癥狀，其中優(yōu)先影響T 細(xì)胞群[19,21]。淋巴細(xì)胞減少和T細(xì)胞衰竭可能是新冠患者臨床惡化的主要原因之一，而T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能是導(dǎo)致重癥患者繼發(fā)性并發(fā)癥的主要因素[21-23]。

1 不同人群中的新冠病毒特異性T細(xì)胞免疫

傳統(tǒng)的T細(xì)胞在表型和功能上具有多樣性，并且在抗病毒持久保護(hù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CD8+T細(xì)胞直接攻擊和殺死病毒感染細(xì)胞，而CD4+T細(xì)胞則是啟動(dòng)CD8+T細(xì)胞和B細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞(圖1)。呼吸道中的CD8+毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)通過(guò)直接殺死受感染的細(xì)胞來(lái)抑制病毒復(fù)制，并分泌包括干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF-α)在內(nèi)的抗病毒細(xì)胞因子[24-25]。CD4+T輔助細(xì)胞則具有多種調(diào)節(jié)抗病毒免疫的關(guān)鍵功能，肺中的記憶 CD4+T 細(xì)胞通過(guò)Th1細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-2、干擾素γ、腫瘤壞死因子等)依賴性等機(jī)制控制早期病毒的復(fù)制[26-27]，Chen等[28]發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞的消耗使得宿主對(duì)病毒的清除變慢，并導(dǎo)致更嚴(yán)重的肺部炎癥。病毒特異性CD4+T和CD8+T 細(xì)胞通過(guò)多種效應(yīng)反應(yīng)來(lái)消除被感染的細(xì)胞，控制炎癥環(huán)境，促進(jìn)體液反應(yīng)的發(fā)生。

在健康的免疫環(huán)境中，受感染的上皮細(xì)胞降解病毒基因組并將其呈遞給T細(xì)胞，T細(xì)胞進(jìn)而分化為CD8+ T細(xì)胞(CTL)和CD4+ T細(xì)胞。CTL通過(guò)經(jīng)典的 TCR-MHC I類(lèi)分子相互作用檢測(cè)病毒蛋白，釋放細(xì)胞毒性顆粒，包括顆粒酶B和穿孔素，并消除受感染的細(xì)胞；CD4+ T細(xì)胞進(jìn)一步分化形成Th1和Th2，其中Th1細(xì)胞通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化吞噬被感染的細(xì)胞，而Th2細(xì)胞則通過(guò)激活B細(xì)胞形成漿細(xì)胞，通過(guò)抗體途徑介導(dǎo)病毒清除。

1.1 新冠患者T細(xì)胞對(duì)新冠病毒的反應(yīng)

新冠患者的病理學(xué)免疫特征主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面(圖2)：(1)以腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-1β等促炎性因子過(guò)量分泌為關(guān)鍵病理特征的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，被認(rèn)為是新冠疾病的主要致病因素[29-30]；(2)新冠患者尤其是重癥患者中導(dǎo)致免疫失調(diào)的T細(xì)胞功能紊亂[18,23,31]。當(dāng)病毒入侵機(jī)體時(shí)，正常的T細(xì)胞介導(dǎo)抗病毒活性殺死被感染的細(xì)胞，而病理性T細(xì)胞則會(huì)過(guò)度活化導(dǎo)致組織炎癥和損傷，這取決于宿主免疫反應(yīng)的狀態(tài)[32]。

在紊亂的免疫環(huán)境中，CD4+ T和 CD8+ T細(xì)胞無(wú)法提供足夠的細(xì)胞或體液介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來(lái)消除病毒感染的細(xì)胞。一方面，T細(xì)胞可能會(huì)耗盡，通過(guò)未知機(jī)制過(guò)度表達(dá)耗竭標(biāo)記，包括PD-1、CTLA-4、TIM-3和TIGIT，誘導(dǎo)大量的炎性分子的產(chǎn)生，包括IL-1β、IL-6、IL-2、IL-10和TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生；另一方面，Th0 細(xì)胞趨向 Th17 表型分化，從而抑制Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在細(xì)胞炎性因子風(fēng)暴的作用下，CTL和巨噬細(xì)胞殺傷活性被抑制，無(wú)法完成殺傷被感染細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致肺炎的進(jìn)一步發(fā)展。

Weiskopf 等[33]研究證明在新冠患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞在癥狀出現(xiàn)后的前2周內(nèi)被檢測(cè)到。該研究進(jìn)一步表明，大多數(shù)新冠病毒特異性CD4+T 細(xì)胞表現(xiàn)出中樞記憶表型，主要產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子，而 CD8+T細(xì)胞具有更多的效應(yīng)表型，其穿孔素的表達(dá)水平較高[33]。與健康對(duì)照組相比，在重癥COVID-19患者體內(nèi)檢測(cè)到的記憶 CD8+T細(xì)胞和 CD8+PD-1+CD38+T細(xì)胞的存在，其高表達(dá)穿孔素和顆粒酶B，這意味著某些細(xì)胞因子如PD-1和CD38在COVID-19病例中可以作為T(mén) 細(xì)胞活化的標(biāo)志物[34]。這兩項(xiàng)研究都報(bào)告了COVID-19患者T細(xì)胞活化的異質(zhì)性，并證明了CD4+T和 CD8+T細(xì)胞都能夠產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)，并可能出現(xiàn)受損或過(guò)度的T細(xì)胞反應(yīng)。

COVID-19患者的總淋巴細(xì)胞數(shù)量，特別是T細(xì)胞數(shù)量低于健康對(duì)照組[37]，有癥狀的COVID-19肺炎患者較無(wú)癥狀感染者淋巴細(xì)胞減少更加明顯[31,38-39]，而重癥患者CD4+T和CD8+T細(xì)胞血計(jì)數(shù)均較中度患者進(jìn)一步下降[40-41]。此外，與重癥患者相比，輕度COVID-19患者的T細(xì)胞比例有所增加，具有較高水平的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞，表達(dá)更高水平的細(xì)胞毒性分子，如顆粒酶 A 和 FAS 配體，這些分子有利于消除被病毒感染的細(xì)胞，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的抗病毒免疫反應(yīng)[42-43]。在患者體內(nèi)，T細(xì)胞亞群(調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg、Th1、Na?ve等T細(xì)胞)平衡失調(diào)，可能導(dǎo)致嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)甚至是COVID-19的復(fù)發(fā)[44-45]。

1.2 康復(fù)患者新冠病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答

在COVID-19康復(fù)患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中，存在特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞對(duì)新冠病毒的反應(yīng)[46-48]，該反應(yīng)不僅針對(duì)刺突蛋白，還針對(duì)膜蛋白、核衣殼蛋白和其他開(kāi)放閱讀框[46]。新冠病毒特異性T細(xì)胞反應(yīng)與新冠病毒刺突蛋白特異性抗體滴度顯著相關(guān)[14,46,48-49]，同時(shí)也有研究表明即使沒(méi)有新冠病毒特異性抗體，也可以引發(fā)記憶性T細(xì)胞反應(yīng)[50]。關(guān)于病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答的激活驗(yàn)證，通常采用的有3種方法：干擾素-γ的酶聯(lián)免疫吸附點(diǎn)(ELISpot)、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS)或激活誘導(dǎo)標(biāo)記(AIM)。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色發(fā)現(xiàn)，新冠病毒特異性T細(xì)胞主要表現(xiàn)出效應(yīng)記憶(EM)表型[49]。然而，T細(xì)胞的表型在離體刺激過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化，從而引起“假陽(yáng)性的特異性T細(xì)胞”結(jié)果的產(chǎn)生。該缺點(diǎn)可以通過(guò)結(jié)合免疫顯性表位及其主要組織相容性復(fù)合體即MHC限制信息，使用MHC多聚體染色技術(shù)來(lái)克服，這也是驗(yàn)證T細(xì)胞激活最直接且可信的方法。一些研究MHC多聚體染色的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了新冠病毒特異性T細(xì)胞的存在[46,51-53]。

在康復(fù)患者中，MHC-I多聚體染色顯示新冠病毒特異性 CD8+T 細(xì)胞分化表現(xiàn)出效應(yīng)記憶(EM，CCR7-CD45RA-; 約50%)和中樞記憶(CM，CCR7+CD45RA-，約20%)表型[14]。在另一項(xiàng)研究中，新冠病毒特異性MHC-I四聚體陽(yáng)性的CD8+T 細(xì)胞在康復(fù)期表現(xiàn)出早期分化的記憶表型(CCR7+CD127+CD45RA-/+TCF1+)[50]。此外，靶向不同病毒蛋白的CD8+T細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的多功能性。與刺突蛋白特異性CD8+T 細(xì)胞相比，膜蛋白或核衣殼蛋白特異性CD8+T細(xì)胞具有更好的多功能性，即在受刺激時(shí)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子的能力更強(qiáng)[14]。靶向不同病毒蛋白的CD4+T細(xì)胞在康復(fù)期則表現(xiàn)出不同的分化模式。刺突蛋白特異性CD4+T細(xì)胞具有濾泡輔助性T細(xì)胞(TFH)的特征，而新冠病毒膜蛋白或核衣殼蛋白特異性 CD4+T 細(xì)胞具有指示Th1/Th17 細(xì)胞的特征[50]。然而，盡管Th2細(xì)胞反應(yīng)在某些肺部疾病中起作用，但來(lái)自COVID-19康復(fù)者的刺突蛋白、膜蛋白或核衣殼蛋白特異性 T 細(xì)胞很少或沒(méi)有產(chǎn)生Th2細(xì)胞因子[46,54]。

1.3 未暴露個(gè)體對(duì)新冠病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答

隨著新冠病毒T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)研究的增加，越來(lái)越多的研究證明未暴露群體的淋巴細(xì)胞對(duì)新冠病毒的抗原肽庫(kù)表現(xiàn)出顯著的反應(yīng)性[33,34,46-47]。Le Bert等[47]對(duì)17年前非典康復(fù)的患者進(jìn)行了檢查，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞對(duì)新冠病毒具有持久的交叉反應(yīng)，檢測(cè)出未暴露個(gè)體對(duì)核衣殼蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白7和非結(jié)構(gòu)蛋白13的新冠病毒反應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答。除此之外，還有一些研究使用預(yù)測(cè)MHC-I或MHC-II結(jié)合的肽，在40%～60%的未暴露的健康個(gè)體中發(fā)現(xiàn)了新冠病毒反應(yīng)性T細(xì)胞，這表明一般人群中存在交叉反應(yīng)性T細(xì)胞和被動(dòng)免疫[34,46,55]。值得一提的是，我們先前的研究采用T-Scan技術(shù)篩選到了一些在冠狀病毒中保守的多肽表位，并在健康未暴露個(gè)體中檢測(cè)到了CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，也進(jìn)一步證實(shí)了預(yù)存免疫的存在[56]。

總之，大量新冠反應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)存在于許多未接觸的人群中已被證實(shí)，這可能與交叉反應(yīng)性T細(xì)胞或大量反應(yīng)性前體細(xì)胞的存在相關(guān)[46,57-59]。這些人群的新冠特異性T細(xì)胞可能來(lái)源于暴露于普通感冒冠狀病毒(CCCs)，如HCoV-OC43、HCoV-HKU1等在人類(lèi)中廣泛傳播、引起輕度呼吸道疾病的冠狀病毒，具有高水平的預(yù)存記憶T細(xì)胞的人，在暴露于新冠病毒時(shí)能夠產(chǎn)生更快、更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。然而，新冠感染的異常和過(guò)度免疫反應(yīng)部分也可能依賴于T細(xì)胞免疫記憶，這在成人中較兒童更明顯，具體表現(xiàn)為新冠病死率在老年人中高于年輕人，而在兒童中幾乎不存在。

1.4 疫苗接種者新冠病毒特異性T細(xì)胞應(yīng)答

針對(duì)新冠病毒的循環(huán)抗體是短暫且低效的，因此，疫苗誘導(dǎo)的記憶淋巴細(xì)胞的快速擴(kuò)增對(duì)增強(qiáng)免疫力和減少 COVID-19 疾病的發(fā)生和傳播顯得尤為重要[60-62]。研究表明疫苗接種不僅可以成功引發(fā)中和抗體，還可以成功引發(fā)新冠病毒特異性 CD4+T和 CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)[46,63-65]。Gallagher等[66]發(fā)現(xiàn)接種疫苗的個(gè)體對(duì)野生型刺突蛋白和核衣殼蛋白具有強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，甚至比恢復(fù)期的患者更明顯。

2 突變株引起的免疫逃逸

新冠病毒雖然是一種含有3′-5′外切核糖核酸酶(ExoN)校正活性的RNA病毒。迄今為止，已經(jīng)確定了主要的5大類(lèi)新冠病毒變體(https:∥www.gisaid.org/)，被命名為值得關(guān)注的變體(VOCs)，分別是阿爾法變種(B.1.1.7)、貝塔變種(B.1.351)、伽馬變種(P.1)、德?tīng)査兎N(B.1.617.2)以及奧密克戎變種(B.1.1.529)。除了感染能力的提高，新冠變種也增強(qiáng)了免疫逃逸能力，有研究表明更具傳播性的變異可能對(duì)當(dāng)前可用的疫苗反應(yīng)較弱[67-69]。有報(bào)道病例第二次被貝塔變種感染，進(jìn)一步證明了這種VOC可以逃避機(jī)體的免疫屏障[70]。以德?tīng)査兎N為例，與野生型病毒相比，新冠病毒康復(fù)者血清中和抗體能力、疫苗的防護(hù)效果和治療性單克隆抗體中和能力均有顯著下降[71]。因此，這些變異對(duì)預(yù)防感染和控制流行病提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[57,72]。

(a)錨定和進(jìn)入宿主細(xì)胞，突變株S蛋白與ACE2受體的親和力增加有助于病毒的入侵；(b)感染或疫苗誘導(dǎo)的特異性抗體介導(dǎo)的體液免疫，突變株S蛋白與抗體的親和力下降，削弱抗體的保護(hù)作用；(c)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，突變株產(chǎn)生的多肽表位與效應(yīng)T細(xì)胞的親和力下降，產(chǎn)生細(xì)胞免疫逃逸。

除了體液免疫之外，T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答的逃逸也可能促進(jìn)了新冠病毒優(yōu)勢(shì)變種的不斷傳播(圖4)。Gallagher等[66]發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，接種疫苗的健康人對(duì)刺突蛋白變異株(B.1.1.7、B.1.351 和 B.1.1.248)的 T 細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度有所減弱。Motozono等[73]的研究也表明，新冠病毒刺突蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)中出現(xiàn)的L452R和Y453F突變逃避了HLA-A 24限制的細(xì)胞免疫，其中L452R能增加刺突蛋白的穩(wěn)定性、病毒感染性和病毒融合原性，從而促進(jìn)病毒復(fù)制。Zhang等[56]進(jìn)一步對(duì)COVID-19康復(fù)期樣本中的新冠多肽表位進(jìn)行了系統(tǒng)分析，也發(fā)現(xiàn)新冠病毒突變表位降低了細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)通過(guò)解析相關(guān)表位與對(duì)應(yīng)HLA-A蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，證明了新冠病毒刺突蛋白突變位點(diǎn)的K417和L452在介導(dǎo)HLA-A識(shí)別中起關(guān)鍵作用。在進(jìn)一步的T細(xì)胞應(yīng)答中，TCR主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)是由特定抗原表位引起的在個(gè)體之間是不同的TCR序列(個(gè)體特異性T細(xì)胞應(yīng)答)；另一類(lèi)是經(jīng)常在多個(gè)不相關(guān)個(gè)體中觀察到的TCR組合(公共T細(xì)胞應(yīng)答)。公共TCR在對(duì)多種人類(lèi)病毒的免疫應(yīng)答中都有描述，包括巨細(xì)胞病毒(CMV)、艾滋病毒(HIV)、EBV[75]，以及最近的SARS-CoV-2[53]。有研究確定了COVID-19恢復(fù)期患者與HLA-A*02:01和兩條來(lái)自SARS-CoV-2刺突蛋白表位(YLQ和RLQ)復(fù)合物的TCR結(jié)構(gòu)，闡明TCR識(shí)別免疫顯性可變表位(YLQ)和保守但不常見(jiàn)的靶向表位(RLQ)的機(jī)制[76](圖4)。盡管突變會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞免疫逃逸，但也有研究表明T細(xì)胞在受感染或接種疫苗的個(gè)體中可以引發(fā)針對(duì)VOCs的強(qiáng)大的交叉反應(yīng)性免疫應(yīng)答，提示了疫苗的有效性和免疫持久性[77]。總之，有關(guān)突變時(shí)如何影響下游TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，及其對(duì)T細(xì)胞活化或抑制的影響，還需要更深入的研究。

(a)pHLA-A復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖，由多態(tài)性HLA-A α重鏈、β2m恒定輕鏈和抗原多肽組成；(b)HLA-A與多肽結(jié)合槽細(xì)節(jié)示意圖，抗原表位YLQPRTFLL結(jié)合在HLA-A α重鏈結(jié)合槽中；(c)pHLA-A-TCR復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖。

3 總結(jié)

隨著研究不斷深入，感染狀態(tài)、宿主免疫和疾病軌跡之間的關(guān)系將更加清晰。盡管T細(xì)胞對(duì)新冠病毒的耐受性仍有待確定，但目前的數(shù)據(jù)和人類(lèi)感染其他冠狀病毒的過(guò)去經(jīng)驗(yàn)證明了其持久性的潛力、控制病毒復(fù)制和宿主疾病的能力，以及疫苗誘導(dǎo)保護(hù)的重要性。在新冠病毒感染中，病毒特異性CD4+T和CD8+T細(xì)胞在保護(hù)性免疫中的作用不如中和抗體的作用那么明確。此外，新冠病毒特異性CD4+T和CD8+T 細(xì)胞的壽命，以及普通冠狀病毒誘發(fā)的預(yù)存新冠病毒反應(yīng)性T細(xì)胞功能仍有待進(jìn)一步研究。