劉玉兵，劉辰辰，千日成

(同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院，上海 200072)

哺乳動(dòng)物精子與卵子受精后形成合子，來源于精子和卵子的染色體重構(gòu)為一套新的染色體。初期源于精子和卵子的基因組是轉(zhuǎn)錄沉默的，一直到合子基因組激活(zygotic genome activation, ZGA)，合子基因組開始轉(zhuǎn)錄，胚胎由母型控制逐步轉(zhuǎn)換為合子型控制[1]。ZGA不是一個(gè)瞬時(shí)的事件，而是一個(gè)合子基因逐漸激活轉(zhuǎn)錄的過程。主要包括兩個(gè)階段：早期卵裂期間發(fā)生的小規(guī)模合子基因激活(minor ZGA)，晚期卵裂期發(fā)生的大規(guī)模合子基因組激活(major ZGA)[1-2]。不同物種之間ZGA的起始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間差異很大，但是在同一物種內(nèi)，該過程受到嚴(yán)格控制，如人類minor ZGA主要發(fā)生在4細(xì)胞階段，小鼠minor ZGA主要發(fā)生在2細(xì)胞階段[3]。ZGA是早期胚胎繼續(xù)發(fā)育的必要條件，它如何起始以及如何調(diào)控一直是個(gè)謎[4]。在低等動(dòng)物中，ZGA是由母源的先導(dǎo)因子控制的。如果蠅中母源的Zelda基因在ZGA中發(fā)揮主要作用[5-6]，但是在哺乳動(dòng)物中尚未找到控制ZGA的母源因子。

DUX4(double homeobox 4, DUX4)最初在面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥(facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD)患者肌肉細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，其異常表達(dá)會(huì)激活人類早期胚胎特異基因和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[7-8]。有不同的研究團(tuán)隊(duì)[9-12]在細(xì)胞模型中同時(shí)發(fā)現(xiàn)DUX4可以激活數(shù)百種ZGA基因(如ZSCAN4、KDM4E和PRAMEF家族基因)和逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子(MERVL/HERVL家族)，DUX4可能是調(diào)控人類胚胎ZGA的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。為了增強(qiáng)對(duì)早期胚胎基因組激活機(jī)制的深入了解，本文對(duì)人類DUX4及其在小鼠中的同源基因Dux在早期胚胎發(fā)育中的作用進(jìn)行綜述。

1 DUX4的基因結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)

人類DUX4基因以11到100個(gè)單位的數(shù)組嵌套在4號(hào)染色體的D4Z4大衛(wèi)星重復(fù)序列中(圖1)，靈長類動(dòng)物的DUX4基因位于端?；蛑z粒周圍區(qū)域，而小鼠Dux串聯(lián)重復(fù)序列位于類似于亞著絲粒的小鼠特異性染色體融合點(diǎn)附近[13]。

每個(gè)D4Z4重復(fù)單元都包含1個(gè)啟動(dòng)子和1個(gè)DUX4開放閱讀框，但缺少聚腺苷酸化信號(hào)(polyadenylation signal, PAS)，導(dǎo)致DUX4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物迅速降解[14]。只有從4qA等位基因上的遠(yuǎn)端D4Z4單元中起始的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以延伸至重復(fù)序列之外，并到達(dá)側(cè)翼pLAM序列中的PAS，所得的多聚腺苷酸尾巴可穩(wěn)定DUX4 mRNA，并使其翻譯成蛋白質(zhì)[15-18]。DUX4屬于雙同源盒轉(zhuǎn)錄因子，雙同源盒轉(zhuǎn)錄因子是真獸類哺乳動(dòng)物所特有的，特征是兩個(gè)間隔很近的同源框(paired-related-domain,PRD)[19]。同源框可以編碼60個(gè)氨基酸的同源域(homeodomains, HDs)，以頭對(duì)頭的方式與DNA結(jié)合[20]。

2 DUX4基因在人類早期胚胎發(fā)育中的作用

DUX4基因的過度表達(dá)與面肩肱型肌營養(yǎng)不良癥(FSHD)有關(guān)，在人類肌肉細(xì)胞和干細(xì)胞中過表達(dá)DUX4，會(huì)引起早期ZGA基因上調(diào)，包括ZSCAN4、ACRO1、HSATII衛(wèi)星重復(fù)序列相關(guān)基因以及HERVL逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子等[22-23]。DUX4 mRNA及蛋白在人類胚胎ZGA之前(2細(xì)胞到4細(xì)胞階段)表達(dá)，而其預(yù)測的靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物約出現(xiàn)在2細(xì)胞階段，在8細(xì)胞階段達(dá)到峰值，與ZGA過程重合[9-10, 24]，提示DUX4可能有直接激活ZGA轉(zhuǎn)錄譜的作用。

在過表達(dá)DUX4的人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)和肌肉細(xì)胞中獲得的ChIP-seq(chromatin immunoprecipitation sequencing)數(shù)據(jù)顯示，DUX4主要與早期ZGA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start sites,TSS)區(qū)域結(jié)合，與母源基因和晚期ZGA基因結(jié)合較少。DUX4還與一些基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的相鄰序列結(jié)合，可通過替代啟動(dòng)子以驅(qū)動(dòng)其靶基因的表達(dá)[23]。將DUX4結(jié)合基因與人類胚胎單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)早期ZGA基因與DUX4結(jié)合位點(diǎn)重疊。另外，DUX4還被募集到幾組轉(zhuǎn)座子(transposable elements,TEs)上，特別是內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子，如HERVL、MER11B和C。DUX4還與激活的長末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)，如MLT2A1、MLT2A2和HSATII衛(wèi)星序列結(jié)合[25]。所有這些與DUX4結(jié)合的基因、轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列，其表達(dá)在ZGA時(shí)也增加，提示DUX4可能通過與靶基因結(jié)合，啟動(dòng)了合子基因組的轉(zhuǎn)錄激活。以上結(jié)果僅僅是在細(xì)胞模型中進(jìn)行研究和推測，由于材料和實(shí)驗(yàn)方法的限制，DUX4在人類胚胎中的作用研究進(jìn)展緩慢。

近年來，科學(xué)家成功開發(fā)出微量起始樣本的染色質(zhì)開放性(chromatin accessibility)檢驗(yàn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了人類胚胎染色質(zhì)開放性和轉(zhuǎn)錄組的同時(shí)檢測[26-29]，DUX4在人類早期胚胎發(fā)育過程中的結(jié)合位點(diǎn)和靶基因表達(dá)情況才得以研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 782個(gè)DUX4結(jié)合位點(diǎn)(通過ChIP-seq技術(shù)在hESCs中檢測到的)中有697個(gè)在胚胎早期階段染色質(zhì)是開放的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DUX4結(jié)合位點(diǎn)在2到8細(xì)胞階段之間表現(xiàn)出染色質(zhì)的瞬時(shí)開放，但許多DUX4靶基因(將位于DUX4結(jié)合位點(diǎn)上10 kb或下游10 kb的基因定義為DUX4靶基因)的表達(dá)水平卻并不是同步變化的。主要有3種不同的模式，第1組基因在4和8細(xì)胞階段瞬時(shí)增加，如ZSCAN4、LEUTX、KDM4E和KLF17；第2組基因在胚胎發(fā)育過程中表達(dá)量逐漸下調(diào)，這些可能是母源基因；第3組中的基因顯示出逐漸增加的表達(dá)趨勢(shì)，這表明DUX4可能啟動(dòng)了其他在胚胎發(fā)育后期起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子[26-27]。推測DUX4主要通過與靶基因結(jié)合，在早期誘導(dǎo)廣泛的染色質(zhì)重塑來觸發(fā)ZGA。但是如何在胚胎水平驗(yàn)證這一結(jié)論，目前仍是一個(gè)難題。利用CRISPR/Cas9技術(shù)顯微注射小鼠胚胎進(jìn)行Dux基因敲除，敲除效率只有5.6%，不適合在人類胚胎發(fā)育中進(jìn)行基因功能研究。本課題組前期利用腺嘌呤堿基編輯器(adenine base editor, ABE)將多拷貝基因簇DUX4基因的起始密碼子進(jìn)行破壞，在人類胚胎中實(shí)現(xiàn)了DUX4基因的沉默(編輯效率可以達(dá)到80%，見圖2)，發(fā)現(xiàn)DUX4沉默可以引起胚胎早期發(fā)育阻滯，轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)DUX4主要影響合子基因組激活和母源基因降解過程，DUX4可能是人類胚胎基因組激活啟動(dòng)的關(guān)鍵先鋒轉(zhuǎn)錄因子(圖3)。

圖2 在人類胚胎中實(shí)現(xiàn)高效的DUX4基因編輯

圖3 DUX4基因在人類早期胚胎發(fā)育中的作用

3 總結(jié)與展望

綜上所述，通過胚胎干細(xì)胞模型和胚胎模型發(fā)現(xiàn)，人類DUX4主要通過與靶基因和衛(wèi)星重復(fù)序列以及逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)座子結(jié)合，調(diào)控染色質(zhì)開放性，進(jìn)而誘導(dǎo)早期胚胎ZGA相關(guān)基因和特異性重復(fù)序列表達(dá)，DUX4是ZGA的一個(gè)重要的起始因子。由于材料限制和缺少高效的基因編輯工具，直接在人類胚胎中進(jìn)行基因功能研究十分困難，DUX4是否是人類ZGA所必須的仍然不清楚，DUX4的上游調(diào)控機(jī)制仍然認(rèn)識(shí)不足，DUX4在人類胚胎中的作用還需要進(jìn)一步研究。