劉琳玲，涂劍鋒，鄭軍軍，張 如，宋姍姍，楊福合，王桂武

(中國農(nóng)業(yè)科學院 特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物學國家重點實驗室，農(nóng)業(yè)部特種經(jīng)濟動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，長春 130112)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一種能誘導異位骨發(fā)生的糖蛋白。1965年，Urist等將去鈣骨片段植入到肌肉中誘導新骨生成，從骨片段中提取到的活性物質(zhì)，即骨形態(tài)發(fā)生蛋白首次被發(fā)現(xiàn)并命名；1979年，又從兔骨中分離出BMP2，BMP3和BMP7。Kulessa等研究發(fā)現(xiàn)BMP會抑制毛囊生長和調(diào)控毛囊毛干分化的作用。BMP2對脂肪分化、成骨分化、軟骨生成和生長發(fā)育起著重要作用，可以促進骨組織和軟骨的生成，對細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞凋亡有調(diào)節(jié)作用。1999年，Wilson等在毛囊毛干發(fā)現(xiàn)BMP2。研究發(fā)現(xiàn)，BMP2在老鼠的毛囊發(fā)育與生長中起到重要作用。2基因在內(nèi)蒙古絨山羊絨毛脫落期次級毛囊的毛干周圍強烈表達，在興盛期不表達，說明參與抑制毛囊生長。谷博研究發(fā)現(xiàn)2在遼寧絨山羊次級毛囊發(fā)生、變化、生長和發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。

貂皮是中國東北三寶之一，素有“裘中之王”的美稱。貂皮皮板優(yōu)良，輕柔結(jié)實、毛絨豐厚、色澤光潤。目前，貂種的退化現(xiàn)象比較嚴重，毛皮品質(zhì)變差，毛絨稀疏、針毛變長，如何培育出優(yōu)質(zhì)貂皮的水貂品種為當務之急，有必要加深對貂皮的毛絨品質(zhì)研究。叢波等研究表明，丹麥咖啡水貂針毛和絨毛都顯著長于美國短毛黑水貂。本研究以短毛黑水貂和咖啡水貂為試驗材料，采用直接測序方法分析2基因的單核苷酸多態(tài)性，并對2基因多態(tài)性與毛長性狀進行相關分析，旨在尋找與毛長性狀相關的遺傳標記，為進一步研究水貂毛長性狀的標記輔助選擇提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

252只7月齡雄性水貂血樣采自大連名威貂業(yè)有限公司。在水貂取皮期，心臟采血，用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20 ℃凍存。全血基因組試劑盒提取基因組DNA，溶解于TE中， -20 ℃凍存。

1.2 試劑

全血基因組試劑盒、Marker和Taq DNA聚合酶均購于北京全式金生物技術有限公司。

1.3 引物設計及PCR擴增

根據(jù)雪貂2基因序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號: NW_004569172)為參考，用Primer Premier 5.0 軟件在外顯子1、2和3處各設計1對引物，由生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列、擴增區(qū)域和產(chǎn)物大小見表1。PCR擴增總反應體積為25 μL：上下游引物各0.25 μL，DNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶0.15 μL，10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，dd HO 18.85 μL。擴增條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 20 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃下保存。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產(chǎn)物的測序

將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂凝膠中電泳后用膠回收試劑盒進行擴增片段回收，送生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 引物序列及相關信息Table 1 The primer sequences and information

1.6 SNPs位點確定和基因型分析

利用DNAMAN軟件對基因進行序列比對分析篩查SNPs位點。通過Chromas 5.0軟件根據(jù)測序峰圖進行基因分型。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Popgene1. 32軟件和SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。統(tǒng)計純合度、雜合度、基因型頻率和等位基因頻率等群體遺傳參數(shù)。利用SAS9.4軟件對SNPs位點基因與毛長表型的關聯(lián)分析，以<0.05為差異顯著，<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMP2基因PCR擴增產(chǎn)物檢測

利用設計的3對引物進行2基因擴增，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物(圖1)，BMP2-1引物擴增片段長度為335 bp，BMP2-2引物擴增片段長度為390 bp，BMP2-3引物擴增片段長度為1 080 bp，與預期設計擴增片段長度大小一致。

圖1 水貂BMP2基因3對引物PCR擴增產(chǎn)物電泳圖M.DNA相對分子質(zhì)量標準；1-6.產(chǎn)物;a.BMP2-1；b.BMP2-2；c.BMP2-3Fig.1 Electrophoresis of the products of BMP2 gene in mink from 3 pairs of primersM. DNA Marker；1-6.The products of BMP2 gene; a.BMP2-1；b.BMP2-2；c.BMP2-3

2.2 BMP2基因外顯子的多態(tài)性檢測

對測序結(jié)果進行比對分析，BMP2基因的外顯子1、2、3未發(fā)現(xiàn)SNPs位點，內(nèi)含子1發(fā)現(xiàn)一個SNPs位點。C159T位點有3種基因型(圖2)：CC、TC和TT基因型。

2.3 群體遺傳參數(shù)分析

由表1可知，CC基因型為短毛黑水貂和咖啡水貂的優(yōu)勢基因型。C等位基因為短毛黑水貂和咖啡水貂的優(yōu)勢等位基因。

由表2可知，C159T位點在短毛黑水貂群體中為中度多態(tài)(0.05>PIC>0.25)，而在咖啡水貂群體中表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25)。χ2檢測結(jié)果表明，C159T位點在短毛黑水貂群體顯著偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，在咖啡水貂群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

2.4 C159T位點與水貂毛長性狀的關聯(lián)性分析

C159T位點形成的不同基因型在2種水貂品種中差異不顯著(>0.05)，推測該位點與水貂毛長性狀無關聯(lián)。

2.5 序列分析

對擴增的3個外顯子序列和已發(fā)表的雪貂(NW_004569172.1)，人(NC_000020.11)，家鼠(NC_000068.7)，牛(NC_037340.1)，豬(NC_010459.5)，狗 (NC_006606.3)，馬(NC_009165.3)，羊(NC_040264.1)9個物種的2基因核苷酸序列進行比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和同源性比較分析。

圖2 CC、TC和TT基因型的測序峰圖Fig.2 The sequence peak graph of CC, TC and TT genotypes

表1 BMP2基因C159T位點的基因型頻率和等位基因頻率Table 1 Genotype frequency and allele frequencyof BMP2 C159T locus

表2 2個水貂品種C159T位點遺傳多態(tài)性Table 2 Genetic polymorphism of C159Tlocus in two mink breeds

表3 C159T位點基因型與水貂毛長表型的關聯(lián)分析Table 3 Association of genotype of TC159T locus withhair length phenotype of mink

結(jié)果顯示(表4)水貂與雪貂、狗同源性最高為98.2%，93.7%，與系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果一致，水貂和雪貂親緣關系最近。

3 討 論

BMP2屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族，是一種糖蛋白，包含2個內(nèi)含子和3個外顯子，其編碼區(qū)域位于外顯子2和3上。本研究發(fā)現(xiàn)不同物種間的2基因序列同源性較高。水貂與雪貂同源性最高為98.2%，且與其它哺乳動物的同源性都在81.2%以上，說明2基因保守性很強。水貂和雪貂都屬于鼬科動物，親緣關系最近。

圖3 BMP2基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建Fig. 3 Phylogenetic tree construction of BMP2 gene

表4 BMP2基因同源性比較Table 4 Homology comparison of BMP2 gene %

BMP2是一個多功能蛋白，在動物機體內(nèi)有廣泛的生物學功能。隨著近幾年對BMP2研究的越來越深入，國內(nèi)外科研人員對2基因在生長發(fā)育、繁殖性能、毛囊發(fā)育等的作用進行了大量研究。Devaney等研究發(fā)現(xiàn),脂肪和肌肉質(zhì)量的差異與人類在轉(zhuǎn)錄后2基因調(diào)控元件中的功能性多態(tài)性有關。冷麗等發(fā)現(xiàn)2基因內(nèi)含子2的12 bp插入或者缺失位點對7周齡肉雞的股骨重、脛骨長、腹脂重和腹脂率的表型變異有顯著影響。魏強研究表明2基因與母豬繁殖力顯著相關。BMP2是毛囊誘導的抑制物，在毛囊發(fā)育的休止期表達量高，對毛囊發(fā)育起到抑制作用。

本研究對2基因的3個外顯子設計了3對引物，通過PCR產(chǎn)物直接測序檢測對2種水貂品種進行了多態(tài)性分析，在外顯子2和3中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。這與以前的研究結(jié)果一致。王憑青等采用PCR-SSCP技術檢測2基因外顯子2、3在山羊4個品種中均沒發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。鐘昕在2基因CDS區(qū)進行了多態(tài)性檢測，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點。檢測2基因外顯子1、2和3的部分區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)突變。初步推斷，2基因的外顯子1、2和3序列相對保守。說明2基因的三個外顯子區(qū)域不是影響毛長的功能結(jié)構(gòu)區(qū)域，但是不排除其它區(qū)域有引起功能改變的突變位點，需要進一步的研究。