張宇翔，朱 亮，魏有海*

(1.青海大學農(nóng)林科學院，青海 西寧 810016； 2.農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海 西寧 810016；3.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海 西寧 810016； 4.湖北省十堰市農(nóng)業(yè)科學院/農(nóng)技中心，湖北 十堰 442000)

在青藏高原傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，青稞一直都是優(yōu)勢作物和重要的糧食作物，目前，青稞正從一個地區(qū)性口糧作物的形象逐漸向國際性保健食品的形象轉(zhuǎn)變[1-2]。2019年統(tǒng)計結(jié)果顯示青海省內(nèi)的青稞播種面積已經(jīng)達到6.385×104hm2，占青海省糧食播種總面積的22.79%；青稞產(chǎn)量144.10×104kg，占青海省糧食總產(chǎn)量的13.65%[3]。

農(nóng)田雜草對耕作及防除措施適應(yīng)力極強，青海青稞田雜草危害率達83.7%，是影響青稞產(chǎn)量提高、品質(zhì)提升的重要限制因素[4-5]。近年來，由于青稞栽培技術(shù)的改變和農(nóng)業(yè)機械跨區(qū)作業(yè)，致使原來只在青海東部農(nóng)業(yè)區(qū)零星發(fā)生的旱雀麥，在青稞田迅速蔓延擴散，成為新的惡性難治雜草。在門源縣腦山生態(tài)區(qū)，旱雀麥平均密度達23株/m2[6]。青海大學農(nóng)林科學院雜草課題組引進小麥田除草劑7.5%啶磺草胺水分散粒劑(WG)用于青稞田防除旱雀麥，取得了良好效果。但農(nóng)田雜草與作物之間、不同種類作物之間和相同作物的不同品種之間對除草劑的耐藥性均有較大差異[7]。蘇少泉[8]通過研究發(fā)現(xiàn)，植物對除草劑產(chǎn)生的耐藥性差異與該除草劑作用的靶標和植物體內(nèi)代謝酶活性密切相關(guān)；董雪等[9]、李亞東等[10]通過試驗證明在啶磺草胺作用下，不同小麥品種對其均有明顯的耐藥性差異。但目前關(guān)于不同青稞品種在7.5%啶磺草胺作用時是否具有耐藥性差異及耐藥性產(chǎn)生原因的研究鮮見報道。面對旱雀麥危害日益嚴重、除草劑品種匱乏的生產(chǎn)實際，本研究收集了青海不同地區(qū)的10個青稞主栽品種，對7.5%啶磺草胺的耐藥性水平進行測定，并測定了施藥后不同時期靶標酶(ALS)和代謝酶(GSTs)的活性，探討了青稞品種對除草劑產(chǎn)生耐藥性的機理，為科學評價不同青稞品種對7.5%啶磺草胺的耐藥性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)供試青稞品種。柴青1號、北青1號、北青2號、北青3號、北青4號、北青5號、北青6號、北青8號、昆侖14號、昆侖15號，由青海大學農(nóng)林科學院作物研究所提供，均為青海不同地區(qū)的青稞主栽品種。

(2)供試除草劑。7.5%啶磺草胺水分散粒劑(WG)，由陶氏益農(nóng)(中國)有限公司生產(chǎn)。

(3)供試化學試劑。90%黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、99%2，4-二硝基氯苯(CDNB)、97%硫胺素焦磷酸(TPP)、99%肌酸、99%α-萘酚、99%考馬斯亮藍G-250、98%牛血清蛋白(BSA)、95%還原型谷胱甘(GSH)、99%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、Tris、3-羥基丁酮、丙酮、丙酮酸鈉、MgCl2、硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、95%乙醇、85%磷酸、37.5%鹽酸、98%濃硫酸，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗儀器

紫外分光光度計、 3WPSH-50D型生測噴霧塔(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南京農(nóng)業(yè)機械化研究所)、高速冷凍離心機(ST 16R)、制冰機、恒溫水浴鍋、FA1104-B萬分之一分析天平。

1.3 不同青稞品種對7.5%啶磺草胺的耐藥性測定

本試驗在青海大學農(nóng)林科學院溫室進行，采用盆栽法，以體積比2∶1，將砂土和營養(yǎng)土攪拌并混合均勻后裝入花盆中(直徑10 cm，深8 cm)，每盆播撒20粒青稞種子后覆土3 cm，放入不銹鋼盤中，定時定量澆水，待其長至3葉期開始間苗，每盆保留10株長勢一致的青稞幼苗備用。

試驗設(shè)7.5%啶磺草胺施用劑量分別為3.125、6.25、12.5、25、37.5、50、100 g/hm2，共7個處理。根據(jù)施用劑量準確稱量除草劑后兌水24 mL，使用生測噴霧塔在青稞3葉期從低到高濃度依次噴霧，每個劑量施藥后清洗噴霧塔再進行下一個濃度噴霧，并設(shè)噴施等量清水為對照，重復4次。

施藥后，每天觀察各處理青稞的長勢、葉色等。施藥后14 d測定株高、地上部鮮重，計算各處理的株高抑制率、鮮重抑制率，以抑制率機率值(Y)和濃度對數(shù)值(X)建立回歸方程(Y=a+bX)，計算青稞幼苗的IC50值、耐藥性倍數(shù)。

1.4 7.5%啶磺草胺對青稞ALS活力的影響

(1)酶液的提取。在預冷的研缽中加入1.0 g剪碎的青稞葉片(3葉期)，加入酶提取液4 mL(含有1 mmol/L 丙酮酸鈉、0.5 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L TPP、1.0 μmol/L FAD的磷酸緩沖液)，迅速研磨成勻漿并轉(zhuǎn)移至10 mL離心管，再用4 mL酶提取液沖洗研缽并轉(zhuǎn)入離心管，4 ℃冰箱冷藏10min。于4 ℃、25 000 r/min下離心20 min，取上清液作為粗酶液，向粗酶液緩慢加入硫酸銨晶體至50%飽和度，沉淀2 h 后，4 ℃、25 000 r/min離心30 min，去除上清液，將沉淀用6 mL酶溶解液溶解后待測。

(2)酶活性測定。待青稞幼苗長至3葉期，以7.5%啶磺草胺田間推薦最低量和最高量(12.5 g/hm2和37.5 g/hm2)對莖葉進行噴霧處理，設(shè)噴施清水為對照，處理完畢后移入溫室，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于施藥后第1、3、5、7、9、11、13天采集施藥和空白對照青稞植株地上部分葉片1.0 g，共采集7次，每次重復4次。參考范志金等[11]的試驗方法進行ALS活力測定?？扇苄缘鞍缀繙y定采用考馬斯亮藍G-250法[12]。設(shè)處理組酶活力與對照組酶活力的比值為ALS相對活力。

1.5 7.5%啶磺草胺對青稞GSTs活力的影響

(1)酶液提取。取青稞3葉期葉片1.0 g，剪碎后放入預冷的研缽中，加入8 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0，含25 mmol/L還原型谷胱甘肽及質(zhì)量分數(shù)為5%的PVP)研磨成勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液12 000 r/min離心5 min，取上清液做酶液，于4 ℃下保存，待測。

(2)酶活性測定。待青稞幼苗長至3葉期，以7.5%啶磺草胺田間推薦劑量12.5 g/hm2和37.5 g/hm2對莖葉進行噴霧處理，以噴清水為對照，處理完畢后移入溫室，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于施藥后第1、3、5、7、9、11、13天采集施藥和空白對照青稞植株地上部分1.0 g，共采集7次，每次重復4次?；钚詼y定在10 mL具塞試管中加入3 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)和0.1 mL酶反應(yīng)液，每管重復3次，于25 ℃保溫10 min，加入0.1 mL濃度為13 mmol/L的CDNB溶液，反應(yīng)10 min，采用紫外分光光度計于340 nm處測OD值，并作為酶活力單位。設(shè)處理 OD值與同期對照OD值的比值為GSTs相對活力。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0進行分析處理，用Excel 2016作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同青稞品種對7.5%啶磺草胺的耐藥性測定

耐藥性測定結(jié)果見表1。由表1可知，北青8號、北青4號、北青6號、昆侖14號、北青3號、柴青1號、北青1號、昆侖15號、北青5號、北青2號的IC50值依次為22.376、20.379、17.516、13.573、12.323、10.374、9.526、7.731、7.197、5.504 g/hm2，其中北青8號耐藥性最強，北青2號最為敏感。以IC50值最低的北青2號為敏感性品種，各青稞品種的耐藥性倍數(shù)依次為4.065、3.703、3.182、2.466、2.239、1.885、1.731、1.405、1.402、1.000。因此，選擇耐藥性最強的北青8號和耐藥性最弱的北青2號，進一步測定施用不同濃度7.5%啶磺草胺后，兩個青稞品種體內(nèi)ALS和GSTs活力差異。

表1 不同青稞品種對啶磺草胺的耐藥性差異

2.2 7.5%啶磺草胺對兩個青稞品種ALS活力的影響

未施藥的兩個青稞品種ALS活力變化見圖1。同一時間下未施藥的北青8號與北青2號的ALS活力沒有表現(xiàn)出明顯差異，并且隨著時間變化，兩個青稞品種的ALS活力變化不明顯，為2.356～2.721 nmol/(h·mg)。不同濃度7.5%啶磺草胺對兩個青稞品種ALS相對活力影響如圖2所示。施藥后兩個青稞品種ALS相對活力均受到明顯抑制，施藥后第1天受抑制最顯著(ALS相對活力最低)，隨后逐漸恢復至對照水平。7.5%啶磺草胺濃度為12.5 g/hm2時，北青8號的ALS相對活力在第5天恢復至1.160，北青2號在第7天恢復至1.000。當7.5%啶磺草胺濃度為37.5 g/hm2時，北青8號的ALS相對活力在第7天恢復至0.968，而北青2號ALS相對活力最高僅恢復為0.763。說明不同青稞品種間耐藥性差異產(chǎn)生的原因與不同青稞品種ALS對7.5%啶磺草胺敏感性強弱有關(guān)，在青稞田間施用7.5%啶磺草胺時濃度的安全劑量為12.5 g/hm2。

圖1 未施藥處理兩個青稞品種ALS活力Fig.1 ALS activity of two varieties of Hordeum vulgare var nudumwithout applying drugs

圖2 不同濃度7.5%啶磺草胺對兩個青稞品種ALS相對活力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of 7.5% pyroxsulam on ALS relative activity of two Hordeum vulgare var nudum varieties

2.3 7.5%啶磺草胺對兩個青稞品種GSTs活力的影響

未施藥兩個青稞品種的GSTs活力見圖3。兩個青稞品種的GSTs活力變化均不明顯，且二者的GSTs活力差異不顯著。不同濃度7.5%啶磺草胺對兩個青稞品種GSTs相對活力影響如圖4所示。兩個青稞品種在不同濃度除草劑處理后，GSTs相對活力均有明顯變化且反應(yīng)迅速。在12.5 g/hm2和37.5 g/hm2濃度除草劑處理后第1天，北青2號GSTs相對活力分別為1.402和1.249，北青8號GSTs相對活力分別為1.278和1.218，施藥后第3天，兩個青稞品種的GSTs相對活力均達到峰值，之后開始下降，第9天基本恢復至對照水平。在兩個濃度7.5%啶磺草胺作用下，施藥后第3天，北青8號的GSTs相對活力分別為1.626和1.586，北青2號的GSTs相對活力分別為1.456和1.324。北青8號在兩個濃度除草劑作用下GSTs相對活力達到峰值時變化幅度小于北青2號，說明北青8號GSTs相對活力大于北青2號。在不同濃度7.5%啶磺草胺作用下兩個青稞品種GSTs活力均表現(xiàn)出一樣的變化趨勢，但北青8號的峰值變化幅度小于北青2號，整體GSTs相對活力大于北青2號。由此可知，北青8號體內(nèi)GSTs反應(yīng)更迅速、解毒能力更強，也說明不同青稞品種對7.5%啶磺草胺產(chǎn)生耐藥性差異的原因與不同青稞品種體內(nèi)GSTs活力有關(guān)。

圖3 未施藥處理兩個青稞品種GSTs活力Fig.3 GSTs activity of two varieties of Hordeum vulgare var nudumwithout applying drugs

圖4 不同濃度7.5%啶磺草胺對兩個青稞品種GSTs相對活力的影響Fig.4 Effects of 7.5% pyroxsulam with different concentrations on GSTs relative activity of twoHordeum vulgare var nudum varieties

3 討論與結(jié)論

青稞作為青藏高原最具地域特色的糧食作物，由于其豐富的營養(yǎng)及較強的抗逆性，成為西藏及青海牧民的主食[13]。本研究明確了青海不同地區(qū)的青稞主栽品種對7.5%啶磺草胺的敏感性，不同青稞品種對該除草劑耐藥性具有較大差異。在供試的10個青稞主栽品種中，北青2號的耐藥性最弱，其耐藥性倍數(shù)為1；北青8號耐藥性最強，其耐藥性倍數(shù)為4.065。李亞東等[10]的研究也證實不同的小麥品種對啶磺草胺的耐藥性具有較大差異。

ALS是支鏈氨基酸合成通路中的第一個酶，在植物生長過程中扮演重要角色，可合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸[14]。本研究結(jié)果表明，在正常生長條件(未施藥)下，北青8號(耐藥性)和北青2號(敏感性)品種體內(nèi)的ALS活力在不同時間段內(nèi)均無顯著差異，這說明正常生長條件下兩個青稞品種的ALS表達并不存在差異。在12.5 g/hm2的7.5%啶磺草胺處理下，兩個青稞品種的ALS活力均顯著下降，但在施藥后第5天，北青8號率先恢復到較高水平，而北青2號在施藥后第13天才恢復到較高水平，說明北青8號比北青2號能更快應(yīng)對7.5%啶磺草胺的脅迫;當施用濃度增大到37.5 g/hm2時，盡管兩個青稞品種的ALS活力均出現(xiàn)顯著下降，但在同一時間北青8號始終高于北青2號，此結(jié)果與張建樹等[15]研究發(fā)現(xiàn)ALS對除草劑的敏感性降低，可能是由于目標植物的ALS對抑制劑產(chǎn)生抗性這一結(jié)論相同。當除草劑濃度為37.5 g/hm2時，這兩個青稞品種的ALS活力上升幅度一直很小，說明當該藥達到這個濃度時，對耐藥性青稞品種和敏感性青稞品種都產(chǎn)生了極度損傷。因此在青稞田應(yīng)用該藥推薦劑量不超過12.5 g/hm2，這與李亞東等[10]在小麥田使用啶磺草胺推薦劑量不超過13.5 g/hm2的結(jié)果相符。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)屬于抗氧化酶家族，在植物生長發(fā)育及壓力應(yīng)激中起著至關(guān)重要的作用[16]。李如男等[17]研究表明，GSTs參與農(nóng)藥在植物體內(nèi)的II相代謝，將農(nóng)藥變?yōu)楸饶阁w的水溶性更強的物質(zhì)，使植物毒性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件(未施藥)下，兩個青稞品種體內(nèi)的GSTs活力在不同時間段內(nèi)均無顯著差異，說明該酶在不同品種間的表達無差異。在12.5 g/hm27.5%啶磺草胺脅迫下，施藥后3 d北青8號的GSTs活力迅速達到峰值，且之后時間段的活力一直高于北青2號，說明在該除草劑的“壓力”下，北青8號應(yīng)對更為迅速。而在該藥濃度為37.5 g/hm2條件下，各個時間點北青8號的GSTs活力均高于北青2號，因此推測在 7.5%啶磺草胺脅迫下，耐藥性品種體內(nèi)GSTs的迅速過表達是其產(chǎn)生耐藥性的原因之一。Kim等[18]研究表明，轉(zhuǎn)入GSTs基因的煙草過表達后對草丁磷的抗性明顯增強，與本文研究結(jié)果相符。本研究篩選出了對7.5%啶磺草胺具有耐藥性的青稞品種，明確了適宜的施藥劑量，探究了抗性產(chǎn)生的原因。