王 娟 田可可 閆 虹 杜 威 呂玉珍

河南省焦作市婦幼保健院(454000)

大多數(shù)生殖中心在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)中篩選最優(yōu)的第3天(D3)胚胎并使用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)分。延時(shí)攝像技術(shù)(TLI)系統(tǒng)作為一種新型胚胎培養(yǎng)及檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)被越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外生殖中心所使用[1]。TLI能使胚胎處于一個(gè)相對(duì)恒定環(huán)境，可獲得傳統(tǒng)培養(yǎng)方法無(wú)法得到的胚胎早期發(fā)育參數(shù)，選擇最有發(fā)育潛能的胚胎，提高臨床妊娠率[2-3]。但是僅使用TLI技術(shù)對(duì)胚胎的選擇仍有不足，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)及卵裂細(xì)胞的增多，圖像辨識(shí)度也會(huì)降低，若聯(lián)合經(jīng)典的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)估(CMA)效果會(huì)更佳。就目前而言，各大生殖中心選擇移植胚胎的TLI各項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)不盡相同。本研究探討胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)聯(lián)合CMA選擇胚胎的臨床結(jié)局，并初步建立選胚模型，以期縮短診療時(shí)間，使患者盡早受孕。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

對(duì)2020年3月-2021年4月在本院行常規(guī)IVF-ET者進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方輸卵管因素不孕；②移植周期數(shù)為1，新鮮周期D3移植；③采用卵泡期長(zhǎng)效長(zhǎng)方案，年齡≤35歲，獲卵數(shù)≥6～15枚。排除標(biāo)準(zhǔn)：取卵當(dāng)天受精率低下或行補(bǔ)救的周期。納入443個(gè)周期，TLI組213例，常規(guī)組230例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批同意(20190429)，參與研究者均簽署了書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 TLI系統(tǒng)使用ESCO(新加坡)TLI系統(tǒng)。

1.2.2胚胎培養(yǎng)方法根據(jù)患者基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平、卵巢儲(chǔ)備等情況按照常規(guī)促排卵方案，當(dāng)1～2枚卵泡直徑≥18 mm 時(shí)注射重組人絨毛膜促性腺激素(rhCG，艾澤，德國(guó)默克雪蘭諾)，37.5～38.0 h陰道B超引導(dǎo)下取卵，所獲卵母細(xì)胞短時(shí)受精4h后拆蛋觀察受精情況。常規(guī)組將受精卵培養(yǎng)皿置于COOK培養(yǎng)箱(6.0% CO2，5.0% O2，37.0℃)培養(yǎng)；TLI組置于TLI培養(yǎng)箱(6.0% CO2，5.0% O2，37.0℃)培養(yǎng)，Miri TL Viewer捕獲軟件拍攝間隔設(shè)置10min。在受精后18～20h 觀察受精原核，44 h和68 h左右觀察胚胎；D3均選擇來(lái)源于2PN胚胎1 ～ 2枚,剩余可利用胚胎進(jìn)行換液后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)至D6，記錄囊胚形成情況。兩組選胚均采用CMA。

1.2.3 CMA根據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)對(duì)分裂期胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分[4]。優(yōu)質(zhì)胚胎的標(biāo)準(zhǔn)和可利用胚胎評(píng)價(jià)指標(biāo)參照胚胎實(shí)驗(yàn)室關(guān)鍵指標(biāo)質(zhì)控專家共識(shí)[5]，根據(jù) Gardne評(píng)分系統(tǒng)[6]進(jìn)行囊胚形態(tài)學(xué)評(píng)分，若評(píng)分3BB及以上囊胚，則判斷為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.2.4 TLI胚胎觀察指標(biāo)受精時(shí)間為起始時(shí)間，記錄原核消失時(shí)間(tPNf)，發(fā)育至2細(xì)胞時(shí)間為t2，第2、3個(gè) 細(xì) 胞 周 期 間 隔 時(shí) 間 為 cc2(t3-t2)和cc3(t5-t3)，標(biāo)志第2、3次細(xì)胞分裂同步性指標(biāo)分別為s2(t4-t3)、s3(t8-t5)；胚胎卵裂模式包括正常卵裂和異常卵裂(非軸性卵裂、不均卵裂、非二倍卵裂、逆卵裂、發(fā)育阻滯、卵裂球融合等)。

1.2.5妊娠觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)移植后常規(guī)行黃體支持。移植后14d檢測(cè)血絨毛膜促性腺激素(β-hCG)，如β-hCG≥50U/L，4～6 周陰道B超下出現(xiàn)孕囊和胎心為臨床妊娠，孕囊數(shù)與移植胚胎數(shù)之比為種植率。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

TLI組較常規(guī)組正常受精率高(χ2=4.876，P=0.027)，其余各項(xiàng)指標(biāo)兩組相比均無(wú)差異。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 TLI 胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)

TLI周期213例，正常卵裂胚胎1611枚，移植胚胎288枚。

2.2.1時(shí)間參數(shù)TLI組著床(n=139)與未著床(n=149)t4、t8、s2、s3比較有差異(Z=3.255，2.443，9.175，P<0.05)，其余指標(biāo)均無(wú)差異。見(jiàn)表2。

表2 TLI培養(yǎng)著床與未著床胚胎時(shí)間參數(shù)比較[h,M(P25,P75)]

2.2.2卵裂模式TLI組正常卵裂(n=725)與異常卵裂(n=886)囊胚形成率比較無(wú)差異；正常卵裂的優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、種植率及流產(chǎn)率高于異常卵裂，流產(chǎn)率低于異常卵裂(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 TLI卵裂正常與異常的胚胎發(fā)育參數(shù)比較(%)

2.3 建立優(yōu)選分層選胚模型及臨床模型驗(yàn)證

2.3.1模型標(biāo)準(zhǔn)建立建模選胚指標(biāo)為TLI胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)聯(lián)合CMA。首選模型A組：細(xì)胞數(shù)7～10[10]，卵裂球均等或稍不均，碎片≤10%；正常卵裂胚胎；TLI t4≤37.00h，t8≤57.00h，s2≤0.75h，s2≤5.50h。次選模型B組：細(xì)胞數(shù)>10或4～6，卵裂球均等或稍不均，碎片≤15%；選擇正常卵裂胚胎，如無(wú)正常卵裂也可選擇異常卵裂中非軸性卵裂、不均卵裂胚胎；如胚胎數(shù)無(wú)8C,參考TLIt4、與s2。

2.3.2臨床模型驗(yàn)證選擇2021年5-7月與上述患者同條件及符合胚胎標(biāo)準(zhǔn)的周期65例， A組均正常卵裂53例，B組12例，有4例異常卵裂(2例不均卵裂；2例非軸性卵裂，其中1例臨床妊娠)。兩組獲卵878枚，正常受精率78.0%(6 85/878)，優(yōu)胚率52.2%(156/299)，妊娠率69.2%(45/65)，種植率56.7%(51/90)，流產(chǎn)率11.1%(5/45)。A組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率與臨床妊娠率均高于B組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組模型分層選胚參數(shù)比較

3 討論

meta分析結(jié)果顯示，采用TLI培養(yǎng)胚胎并結(jié)合TLI胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)參數(shù)選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，可改善IVF-ET妊娠結(jié)局[7],但是關(guān)于TLI選擇胚胎能否改善臨床結(jié)局，說(shuō)法不一[8]，胚胎學(xué)家正致力于尋找與胚胎發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局相關(guān)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)[9-11]。

本研究結(jié)果顯示，TLI培養(yǎng)的胚胎正常受精率高于普通培養(yǎng)(74.4% 與72.0%)，優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率與種植率無(wú)差異。表明TLI可以回顧胚胎發(fā)育全過(guò)程，避免了常規(guī)培養(yǎng)一過(guò)式觀察而錯(cuò)過(guò)兩原核出現(xiàn)的時(shí)間，能增加卵子與胚胎的利用率，既為胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定的外環(huán)境，數(shù)據(jù)又具有可追溯性[12-13]。

靜態(tài)形態(tài)學(xué)評(píng)估是目前大多數(shù)中心常用的評(píng)價(jià)胚胎移植前活力的方式[14]。根據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)[4]，通常4C發(fā)生在D2受精后(44±1)h，8C在D3受精后(68±1)h。人類的合子基因組激活發(fā)生4～8 細(xì)胞階段，此階段的時(shí)間參數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)TLI時(shí)間參數(shù)t4、t8、s2、s3，與胚胎著床密切相關(guān)，有明顯的時(shí)間縮短且同步性強(qiáng)，且這4項(xiàng)指標(biāo)與靜態(tài)評(píng)估主要指標(biāo)仍有一致性。有文獻(xiàn)報(bào)道，t4、s2在區(qū)分整倍體和非整倍體胚胎方面，也有時(shí)間縮短的現(xiàn)象[15]。有研究證實(shí)，卵裂時(shí)間相對(duì)較早，同步性好的胚胎，其發(fā)育至優(yōu)質(zhì)囊胚的幾率更大[16-17]。以上結(jié)論進(jìn)一步說(shuō)明了t4、t8、s2、s3的可靠性，如果篩選這些優(yōu)勢(shì)時(shí)間段內(nèi)的胚胎在D3進(jìn)行移植，能加大獲得妊娠的可能。但t4、t8與靜態(tài)學(xué)觀察的時(shí)間點(diǎn)有較明顯的時(shí)間差，歸其原因或許是動(dòng)態(tài)觀察更能及早發(fā)現(xiàn)發(fā)育速度快的優(yōu)質(zhì)胚胎，真正有潛力的胚胎，靜態(tài)選擇有時(shí)會(huì)忽略。

本研究中的多種胚胎異常卵裂模式都可通過(guò) TLI得到精確記錄，而在靜態(tài)評(píng)分體系中這些異常卵裂常不易發(fā)現(xiàn)。有文獻(xiàn)顯示，胚胎發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)卵裂模式異?？娠@著影響胚胎的種植率，且卵裂異常的胚胎移植后具有較高的流產(chǎn)率[18-19]。本研究結(jié)果表明，卵裂正常較異常的優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率、種植率、流產(chǎn)率有顯著差異，異常卵裂的胚胎可顯著影響胚胎的發(fā)育潛能，且流產(chǎn)率增高。此結(jié)果也能解釋表1中TLI組較常規(guī)組中流產(chǎn)率無(wú)差異的原因，是TLI組未能將卵裂模式作為篩選指標(biāo)，保留了形態(tài)學(xué)觀察正常而卵裂模式異常的胚胎。再次提示了卵裂模式在D3胚胎發(fā)育結(jié)局的重要性，可作為TLI篩選胚胎的參數(shù)。

建模數(shù)據(jù)顯示，正常受精率、利用胚胎率、優(yōu)胚率、臨床臨床妊娠率、種植率較建模前TLI組及常規(guī)組均有提高。Park等[20]報(bào)道，采用TLI培養(yǎng)胚胎者的流產(chǎn)率高于采用傳統(tǒng)培養(yǎng)箱培養(yǎng)胚胎。本文結(jié)論與其有不一致性，在表1中，與常規(guī)組對(duì)比，TLI組的早期流產(chǎn)率并未降低(P>0.05)，通過(guò)建模后，A、B兩組總流產(chǎn)率較TLI組與常規(guī)組有所下降(11.1% 與14.2% 與13.7%)，A組較B組下降的較為明顯(10.3%與16.7%)，雖然A組與B組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)并無(wú)差異(可能與數(shù)據(jù)少有關(guān))，但是B組中有異常卵裂4例，3例未孕，顯著影響臨床結(jié)局。導(dǎo)致流產(chǎn)率降低的原因，有可能是建模后排除了大部分胚胎中某些卵裂球的分裂延遲及異常卵裂[21-22]。研究中B組添加兩種異常分裂模式，是因?yàn)椴痪蚜鸭胺禽S性卵裂的胚胎具有較高的優(yōu)質(zhì)囊胚形成率[23],一是設(shè)計(jì)模型需要，二是防止糾正過(guò)多，增加取消率。數(shù)據(jù)還顯示，A 組較B組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率及臨床妊娠率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(56.0%與38.8%；73.6%與50.0%)。通過(guò)建立TLI胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)(時(shí)間參數(shù)與分裂模式)與形態(tài)學(xué)評(píng)估聯(lián)合分層篩選，按照優(yōu)質(zhì)胚胎、卵裂模式、T4、T8 、s2 、s3的順序依次進(jìn)行，逐層選擇好的D3胚胎移植，將移植后的剩余胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，以優(yōu)質(zhì)囊胚形成率和臨床妊娠率兩者相結(jié)合為最終結(jié)局，判斷該分層模型的有效性，獲得了最佳時(shí)間范圍內(nèi)卵裂的胚胎與范圍之外的胚胎相比較，其優(yōu)質(zhì)胚胎率與臨床妊娠率明顯較高，提升了患者首次移植臨床妊娠率。

綜上所述，胚胎發(fā)育是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，靜態(tài)學(xué)選擇胚胎，存在一定的局限性。但由于不同中心得出的有效指標(biāo)各有不同，多中心大樣本研究可能具有更加廣泛的意義。本研究通過(guò)將TLI動(dòng)力學(xué)參數(shù)聯(lián)合胚胎形態(tài)學(xué)建模，篩選 D3胚胎移植，獲得了較為理想的妊娠結(jié)局，為優(yōu)化胚胎篩選流程及優(yōu)質(zhì)胚胎選擇提供了新的參考依據(jù)。

即便如此，本研究并未對(duì)建模數(shù)據(jù)中患者持續(xù)妊娠率、活產(chǎn)率、新生兒圍生期結(jié)局及遠(yuǎn)期預(yù)后等進(jìn)行進(jìn)一步比較，數(shù)據(jù)量也有不足，故具有一定局限性，將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，根據(jù)產(chǎn)科、新生兒隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)，以確保此方法的有效性和安全性。